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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 急切求助，ELISA空白孔显色
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289363400

铁杆木虫 (知名作家)

凌乱前进方向

[求助] 急切求助，ELISA空白孔显色 已有4人参与

前段时间一直没有问题的，OD450在0.1以下，最近不知道怎么了，空白孔的颜色一直非常明显，几乎与阳性孔没有分别。
我以100微升PBS加100微升包被缓冲液（0.1 M NaCO3，pH 9.6）在4℃过夜包被。
第二天加封闭液，37℃，2h。
加入HRP标记的抗体，37℃，1h。
加入TMB底物缓冲液，结果颜色非常明显。
我分析过可能的影响因素，比如：
1.封闭液试过5%脱脂奶粉、1%BSA;
2.HRP标记的抗体的浓度尝试过1:5000，1:10000和1:15000；
3.实验用的PBS和PBST重新配置；
4.尝试不去过夜包被，而直接从封闭开始；
以上实验的结果全部为空白孔显色！这些实验基本排除了封闭液、包被液、PBS、PBST的问题。
我也尝试过直接向酶标孔中加入显色液，结果是没有颜色的，这也就排除了显色液的问题。
最后我怀疑可能是抗体的问题，但是抗体能有什么问题啊？
求救！
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1楼 2015-01-15 21:56:22
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sunshine436

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-01-16 11:38:44
289363400: 金币+2, ★有帮助, 包被的空白，也就是PBS啊。这个的问题已经排除了。 2015-01-16 14:45:37
请问你包被的是什么？如果以前是好的，现在不好了，有可能是包被的的东西发生了变化

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2楼2015-01-16 09:54:35
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安培试剂

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
289363400: 金币+2, ★有帮助, 谢谢！以前的孵育时间一直都是1小时，空白孔也没有明显显色。现在的洗涤条件已经改为5次，前三次PBST，后两次PBS，应该是没有问题了吧。现在初步怀疑是我每次吸取抗体原液时在枪头上沾染过多，使得抗体浓度配制不准确。 2015-01-17 09:06:44
缩短二抗时间试试。还有非特异吸附的话，增加洗涤条件，降低二抗浓度，洗涤彻不彻底？
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3楼2015-01-16 16:53:07
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hbl215

金虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
289363400: 金币+5, ★★★很有帮助, 关于纸的影响，学习了。现在问题似乎出在吸取抗体原液时枪头沾染过多，使得配制的抗体浓度不准。 2015-01-17 09:08:26
1.封闭用2%bsa。
2.二抗孵育半小时就够了，多了反而背景高。
3.二抗孵育结束的洗板很重要，这一步的洗涤一定要干净。包括放置太久长菌的pbst残留液都会引起假阳性。
4.机洗，手洗？手洗拍板，垫的纸脏的话也有影响的，特别是如果纸屑多还含荧光剂。

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4楼2015-01-16 21:32:41
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iayala

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你好，我认为一种可能是你包被的抗原直接与你的HRP抗体结合了，应该是抗原出现了混淆或者污染，抗原出现属性改变的可能也有，那要看你的抗原是什么了。封闭体系应该没有问题的。
另外就是你的HRP抗体是哪来的，是购买的还是自己合成的，也有可能是HRP抗体上的HRP脱落，那它就会乱结合显色了，这就要你调查了。
祝好运！
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5楼2015-01-17 10:06:54
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