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xiaoqiang100

铁虫 (小有名气)

[求助] ELISA测抗体效价的准确性问题

我用ELISA夹心法测抗体效价,底物是蛋白,一抗是我们要测的抗体,二抗是山羊抗兔的HRP标记的,显色物为OPD。但是我感觉,OPD反应的时间越长,OPD显色就越深,O.D值就越高,这样我们用软件分析得出的抗体的效价就不一样。打个比方说:前面所有的条件完全相同,在显色这一步,我有的显色5分钟,有的显色10分钟。因为显色10分钟的O.D值比五分钟大,那么我算出来的同一种抗体的效价就会不同。这个问题该如何解决呢?另外,我们的抗体还没有商业化抗体,所以无法利用现有的商业抗体进行校准。
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zlee2136

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

xiaoqiang100(金币+2): 我将具体条件写了一下,还请得到你的帮助 2011-09-09 09:12:38
你这种方法应该叫间接ELISA法,请问你检测的抗体有没有做一个稀释梯度?说一个抗体的效价有多少,应该同时要说明你的检测条件,比如:抗原包板浓度,包板时间,一抗稀释度,二抗使用浓度,底物显色时间,各步反应时间等等!不能一概而论,每个实验室的标准都不太一样!
2楼2011-09-08 22:55:58
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xiaoqiang100

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
1楼: Originally posted by xiaoqiang100 at 2011-09-08 21:15:46:
我用ELISA夹心法测抗体效价,底物是蛋白,一抗是我们要测的抗体,二抗是山羊抗兔的HRP标记的,显色物为OPD。但是我感觉,OPD反应的时间越长,OPD显色就越深,O.D值就越高,这样我们用软件分析得出的抗体的效价就不 ...

好的,我将具体条件说一下。
我抗原包被的浓度为8微克/孔,37℃孵育2小时;
百分之五的牛血清蛋白封闭,37℃孵育2小时;
梯度稀释抗体血清,稀释梯度为1:100至1:1000000000,37℃孵育2小时;
PBST洗5次,每次5min;
加入山羊抗兔二抗(我们做的一抗是兔源的),稀释2000,37℃孵育2小时;
PBST洗5次,每次5min;
OPD显色(配方为0.05%w/v的OPD,0.1%v/v的过氧化氢,溶解在ph5.3的柠檬酸缓冲液中);
1M的硫酸中止反应;
5min内测量O.D值。
谁知道一个大学学物理,但研究生阶段天天养细胞的寂寞!?
3楼2011-09-09 09:11:58
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