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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » ELISA测抗体效价的准确性问题
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xiaoqiang100

铁虫 (小有名气)

[求助] ELISA测抗体效价的准确性问题

我用ELISA夹心法测抗体效价，底物是蛋白，一抗是我们要测的抗体，二抗是山羊抗兔的HRP标记的，显色物为OPD。但是我感觉，OPD反应的时间越长，OPD显色就越深，O.D值就越高，这样我们用软件分析得出的抗体的效价就不一样。打个比方说：前面所有的条件完全相同，在显色这一步，我有的显色5分钟，有的显色10分钟。因为显色10分钟的O.D值比五分钟大，那么我算出来的同一种抗体的效价就会不同。这个问题该如何解决呢？另外，我们的抗体还没有商业化抗体，所以无法利用现有的商业抗体进行校准。
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1楼 2011-09-08 21:15:46
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zlee2136

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

xiaoqiang100(金币+2): 我将具体条件写了一下，还请得到你的帮助 2011-09-09 09:12:38
你这种方法应该叫间接ELISA法，请问你检测的抗体有没有做一个稀释梯度？说一个抗体的效价有多少，应该同时要说明你的检测条件，比如：抗原包板浓度，包板时间，一抗稀释度，二抗使用浓度，底物显色时间，各步反应时间等等！不能一概而论，每个实验室的标准都不太一样！
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2楼2011-09-08 22:55:58
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xiaoqiang100

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
1楼: Originally posted by xiaoqiang100 at 2011-09-08 21:15:46:
我用ELISA夹心法测抗体效价，底物是蛋白，一抗是我们要测的抗体，二抗是山羊抗兔的HRP标记的，显色物为OPD。但是我感觉，OPD反应的时间越长，OPD显色就越深，O.D值就越高，这样我们用软件分析得出的抗体的效价就不 ...

好的，我将具体条件说一下。
我抗原包被的浓度为8微克/孔，37℃孵育2小时；
百分之五的牛血清蛋白封闭，37℃孵育2小时；
梯度稀释抗体血清，稀释梯度为1:100至1:1000000000，37℃孵育2小时；
PBST洗5次，每次5min；
加入山羊抗兔二抗（我们做的一抗是兔源的），稀释2000，37℃孵育2小时；
PBST洗5次，每次5min；
OPD显色（配方为0.05%w/v的OPD,0.1%v/v的过氧化氢，溶解在ph5.3的柠檬酸缓冲液中）；
1M的硫酸中止反应；
5min内测量O.D值。
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3楼2011-09-09 09:11:58
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