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包涵体蛋白做间接ELISA，显色不稳定，望做过的高手帮忙看一下，万分感激！！！
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最近在用包涵体蛋白做间接ELISA,但是实验做的不是很顺利,最后加上显色液TMB后显色不稳定，有时候显色，有时候不显色，实验过程、操作以及试剂都检查过了，不会有错。后来考虑是不是问题出在这个包涵体蛋白上面，包涵体纯化，变性剂是尿素，也查了一些相关的知识、帖子，总结如下： 1、变性的融合蛋白做抗原是没有影响的，gst的分子量是26kda，当然，如果将融合伴侣除去，抗体的特异性会要更好一些，如果不除，影响也不会很大。最好进行透析，除去溶液中的杂物质，但是Tris没有什么关系，其就如同PBS一样，本身是缓冲体系，不会对免疫造成太大影响。 2、做抗原的话，变性了没关系的；纯化后可以直接免疫动物，我们这就有人做，不过他是用的His融合表达；挂着GST挺好的，不切也行，蛋白大些岂不是抗原性更强些 这2种说法觉得包涵体纯化后可以直接包被了，也没有复性，做ELISA, 不会受到影响，反而觉得 会更好些 3、帖子：这个问题我想了很久，不过现在也只能给你提供点建议试试，不一定成熟。 我查了一篇文章，后面也附给你，你可以看看，我们一起讨论。 文章中用猪瘟病毒的E2原核表达蛋白来包被ELISA，这种蛋白也是不可溶的，作者使用碳酸盐缓冲系统包被，然后加入盐酸胍增加蛋白质的可溶性（还可以适当的煮沸），从而提高包被系统的均匀性，提高检测的灵敏性和可重复性。 这篇文章我一直没有找到，找到几篇类似的，但没有提到”作者使用碳酸盐缓冲系统包被，然后加入盐酸胍增加蛋白质的可溶性”这句话 其实一直还是有一个疑问，包涵体是不可溶的，但是经过变性之后，是不是可以算是可溶性的了？那这样应该不能包被不上？而且纯化出的蛋白的确也没有沉淀， 望做过的高手帮忙看一下，万分感激！！！ |
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