| 查看: 1180 | 回复: 2 | ||
[求助]
包涵体蛋白做间接ELISA，显色不稳定，望做过的高手帮忙看一下，万分感激！！！
|
|
最近在用包涵体蛋白做间接ELISA,但是实验做的不是很顺利,最后加上显色液TMB后显色不稳定，有时候显色，有时候不显色，实验过程、操作以及试剂都检查过了，不会有错。后来考虑是不是问题出在这个包涵体蛋白上面，包涵体纯化，变性剂是尿素，也查了一些相关的知识、帖子，总结如下： 1、变性的融合蛋白做抗原是没有影响的，gst的分子量是26kda，当然，如果将融合伴侣除去，抗体的特异性会要更好一些，如果不除，影响也不会很大。最好进行透析，除去溶液中的杂物质，但是Tris没有什么关系，其就如同PBS一样，本身是缓冲体系，不会对免疫造成太大影响。 2、做抗原的话，变性了没关系的；纯化后可以直接免疫动物，我们这就有人做，不过他是用的His融合表达；挂着GST挺好的，不切也行，蛋白大些岂不是抗原性更强些 这2种说法觉得包涵体纯化后可以直接包被了，也没有复性，做ELISA, 不会受到影响，反而觉得 会更好些 3、帖子：这个问题我想了很久，不过现在也只能给你提供点建议试试，不一定成熟。 我查了一篇文章，后面也附给你，你可以看看，我们一起讨论。 文章中用猪瘟病毒的E2原核表达蛋白来包被ELISA，这种蛋白也是不可溶的，作者使用碳酸盐缓冲系统包被，然后加入盐酸胍增加蛋白质的可溶性（还可以适当的煮沸），从而提高包被系统的均匀性，提高检测的灵敏性和可重复性。 这篇文章我一直没有找到，找到几篇类似的，但没有提到”作者使用碳酸盐缓冲系统包被，然后加入盐酸胍增加蛋白质的可溶性”这句话 其实一直还是有一个疑问，包涵体是不可溶的，但是经过变性之后，是不是可以算是可溶性的了？那这样应该不能包被不上？而且纯化出的蛋白的确也没有沉淀， 望做过的高手帮忙看一下，万分感激！！！ |
回复此楼» 猜你喜欢
一志愿北京化工大学070300 学硕336求调剂
已经有8人回复
-
一志愿东华大学化学070300，求调剂
已经有6人回复
-
318求调剂
已经有7人回复
-
求调剂一志愿海大，0703化学学硕304分，有大创项目，四级已过
已经有6人回复
-
一志愿武理材料工程348求调剂
已经有5人回复
-
求调剂
已经有7人回复
-
275求调剂
已经有6人回复
-
招08考数学
已经有7人回复
-
303求调剂
已经有6人回复
-
306求调剂
已经有4人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
会思想的芦苇
金虫 (正式写手)
- BioEPI: 2
- 应助: 11 (小学生)
- 金币: 1415.8
- 红花: 2
- 帖子: 360
- 在线: 166.2小时
- 虫号: 1360621
- 注册: 2011-08-04
- 专业: 生物技术药物
2楼2014-04-08 14:43:27
3楼2014-04-08 21:25:10
