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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » Elisa 包被
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waiwaidou_1983

铜虫 (小有名气)

[求助] Elisa 包被

蛋白标准样品等点电是5 用9.6的碳酸盐缓冲液包被，检测样品每次都显色，就是标准样品不显色

将蛋白标准样品 做点杂也没问题，推测应该是包被有问题，但是不知道怎么解决  标准样品 最高浓度的每个孔包被了3.5 ug 然后2倍的逐渐稀释 7次
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1楼 2011-04-25 21:02:25
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)

大洪

【答案】应助回帖

★ ★
reasonspare(金币+2, EPI+1): 谢谢分享 2011-04-26 11:14:36
蛋白标准样品等点电是5 用9.6的碳酸盐缓冲液包被
等点电是5
9.6的碳酸盐缓冲液的9.6只是PH值
根据等电点的定义：由于蛋白质表面离子化侧链的存在，蛋白质带净电荷。由于这些侧链都是可以滴定的（titratable），对于每个蛋白都存在一个pH使它的表面净电荷为零即等电点。
所以你的蛋白标准品用碳酸盐缓冲液包被包被时整个体系的PH是不再是9.6的
应该比9.6小了很多了
蛋白和聚苯乙烯板子结合的详细过程目前上不是很明了，目前认为是通过静电吸附在板子上的，而聚苯乙烯板子一般在出厂前也要经过强电厂处理以提高吸附能力！肯定和蛋白的带电情况有关，包被缓冲液并不一定都是PH9.6 的CB，不同的蛋白选用不同的包被缓冲液可以得最佳的包被效果，从上面可以看出和蛋白的带电情况有明显的相关性！
为什么缓冲液的PH要大于包被蛋白的PI，原因有两点：
一是因为蛋白质与酶标板的结合主要是靠疏水作用的物理吸附。而缓冲液的PH略大于包被蛋白的PI，有利于蛋白质疏水键的适当暴露。
二是因为酶标板聚苯乙烯表面暴露的主要是C－H键，而缓冲液的PH略大于包被蛋白的PI，可以使蛋白质带上负电荷，有利于蛋白质与酶标板的牢固结合，提高包被效率。所以我们常用的包被液体多位PH9.6的碳酸氢钠缓冲液，当然对PI低的蛋白质也有使用PH7.4的包被液的情况。
总之，一句话，不是所有蛋白样品做ELISA的时候用9.6的碳酸盐缓冲液包被都会有好的结果的，这个时候就需要摸索更好的抗原包被液
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青春的岁月，我们身不由己，只因这胸中燃烧的梦想！
2楼2011-04-26 09:53:04
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普通回帖

waiwaidou_1983

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jhu132llh at 2011-04-26 09:53:04:
蛋白标准样品等点电是5 用9.6的碳酸盐缓冲液包被
等点电是5
9.6的碳酸盐缓冲液的9.6只是PH值
根据等电点的定义：由于蛋白质表面离子化侧链的存在，蛋白质带净电荷。由于这些侧链都是可以滴定的（titratable） ...

谢谢，

打算试试 7.4 的PBS

还有看到说先用 0.2%的戊二醛磷酸缓冲液 PH5的先处理1h

或把样品先和BSA偶联 然后再包被  

不知道对这两种方法有什么看法？

还有 我不知道从哪里能送你金币啊？
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3楼2011-04-26 14:28:39
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liuyuhan8061

银虫 (小有名气)
谢谢二楼，同样学习了！！！
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4楼2011-04-27 12:48:14
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waiwaidou_1983

铜虫 (小有名气)
用PH7.4 的PBS包被还是不行，加了显色液后不显色
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5楼2011-04-29 14:44:46
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)

大洪

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
waiwaidou_1983(金币+15): 非常感谢，我再试试 2011-05-03 08:12:52
lstt09nk(金币+8): 很热心 2011-05-04 17:46:12
等电点是5的话
估计一加抗原的时候PH就会比缓冲液的PH低很多了
这个时候我觉得可能碳酸盐缓冲液的缓冲能力是肯定不够的了
要是PBS包被的效果也不行的话
可以考虑购买试剂公司的包被液了
毕竟ELISA也就是检测方法
不值当我们为了这样一个实验来反复摸索优化耗时太多
可以像试剂公司购买专门用于PI比较低的抗原的ELISA包被液
先跟他们讲清楚咱的蛋白PI是5
要做ELISA
要他们推荐一种适用于低PI的蛋白效果好的包被液
可以先要求给个试用装试试
好用再买
不好用或者不给就换一家‘
试剂公司嘛现在满地都是
祝你好运了
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青春的岁月，我们身不由己，只因这胸中燃烧的梦想！
6楼2011-04-30 16:51:09
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
原来一个包被有那么多学问，前阵子一直封闭不好，难道是BSA的反应条件不好？有人知道BSA最佳反应条件么
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7楼2011-04-30 17:50:19
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)

大洪
★ ★ ★ ★
lstt09nk(金币+4): 鼓励 2011-05-04 17:46:23
引用回帖:
Originally posted by gongeleven at 2011-04-30 17:50:19:
原来一个包被有那么多学问，前阵子一直封闭不好，难道是BSA的反应条件不好？有人知道BSA最佳反应条件么

是的
有时候实验就是这样
一直用的好好的BSA不出了
换一个立马就好了
就和我们的WB一样的
以前一直用一模一样的脱脂奶粉
怎么做都出
但是有一次就是怎么也不出
换成BSA立马就出了
这个和每一个具体的蛋白的某些特性有关系
所以。。。。有的时候换换试剂也是一线红解决问题的途径，
也许不知道为什么
但是只要结果出来了
就也不需要知道为什么了
毕竟谁也不是万能的
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青春的岁月，我们身不由己，只因这胸中燃烧的梦想！
8楼2011-05-03 08:35:30
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)

大洪
引用回帖:
Originally posted by jhu132llh at 2011-04-30 16:51:09:
等电点是5的话
估计一加抗原的时候PH就会比缓冲液的PH低很多了
这个时候我觉得可能碳酸盐缓冲液的缓冲能力是肯定不够的了
要是PBS包被的效果也不行的话
可以考虑购买试剂公司的包被液了
毕竟ELISA也就是检测 ...

恩
你在试试
good luck！
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青春的岁月，我们身不由己，只因这胸中燃烧的梦想！
9楼2011-05-03 08:36:05
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waiwaidou_1983

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jhu132llh at 2011-05-03 08:36:05:
恩
你在试试
good luck！

买了一个公司的包被液，还是不显色

我想换个方法。

先包被抗体，

封闭

然后再加我的标样和测试样品

再加之前包被的那个抗体

最后加二抗

就是想用一抗把样品捕获

不知道可不可以

崩溃了，两年前做过，没问题，现在标样就是不显色
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10楼2011-05-04 14:33:38
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