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waiwaidou_1983铜虫 (小有名气)
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Elisa 包被
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蛋白标准样品等点电是5 用9.6的碳酸盐缓冲液包被，检测样品每次都显色，就是标准样品不显色 将蛋白标准样品 做点杂也没问题，推测应该是包被有问题，但是不知道怎么解决 标准样品 最高浓度的每个孔包被了3.5 ug 然后2倍的逐渐稀释 7次 |
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 分子实验常见问题 |
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jhu132llh
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【答案】应助回帖
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reasonspare(金币+2, EPI+1): 谢谢分享 2011-04-26 11:14:36
reasonspare(金币+2, EPI+1): 谢谢分享 2011-04-26 11:14:36
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蛋白标准样品等点电是5 用9.6的碳酸盐缓冲液包被 等点电是5 9.6的碳酸盐缓冲液的9.6只是PH值 根据等电点的定义：由于蛋白质表面离子化侧链的存在，蛋白质带净电荷。由于这些侧链都是可以滴定的（titratable），对于每个蛋白都存在一个pH使它的表面净电荷为零即等电点。 所以你的蛋白标准品用碳酸盐缓冲液包被包被时整个体系的PH是不再是9.6的 应该比9.6小了很多了 蛋白和聚苯乙烯板子结合的详细过程目前上不是很明了，目前认为是通过静电吸附在板子上的，而聚苯乙烯板子一般在出厂前也要经过强电厂处理以提高吸附能力！肯定和蛋白的带电情况有关，包被缓冲液并不一定都是PH9.6 的CB，不同的蛋白选用不同的包被缓冲液可以得最佳的包被效果，从上面可以看出和蛋白的带电情况有明显的相关性！ 为什么缓冲液的PH要大于包被蛋白的PI，原因有两点： 一是因为蛋白质与酶标板的结合主要是靠疏水作用的物理吸附。而缓冲液的PH略大于包被蛋白的PI，有利于蛋白质疏水键的适当暴露。 二是因为酶标板聚苯乙烯表面暴露的主要是C－H键，而缓冲液的PH略大于包被蛋白的PI，可以使蛋白质带上负电荷，有利于蛋白质与酶标板的牢固结合，提高包被效率。所以我们常用的包被液体多位PH9.6的碳酸氢钠缓冲液，当然对PI低的蛋白质也有使用PH7.4的包被液的情况。 总之，一句话，不是所有蛋白样品做ELISA的时候用9.6的碳酸盐缓冲液包被都会有好的结果的，这个时候就需要摸索更好的抗原包被液 |
2楼2011-04-26 09:53:04
waiwaidou_1983
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3楼2011-04-26 14:28:39
liuyuhan8061
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4楼2011-04-27 12:48:14
waiwaidou_1983
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5楼2011-04-29 14:44:46
jhu132llh
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waiwaidou_1983(金币+15): 非常感谢，我再试试 2011-05-03 08:12:52
lstt09nk(金币+8): 很热心 2011-05-04 17:46:12
waiwaidou_1983(金币+15): 非常感谢，我再试试 2011-05-03 08:12:52
lstt09nk(金币+8): 很热心 2011-05-04 17:46:12
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等电点是5的话 估计一加抗原的时候PH就会比缓冲液的PH低很多了 这个时候我觉得可能碳酸盐缓冲液的缓冲能力是肯定不够的了 要是PBS包被的效果也不行的话 可以考虑购买试剂公司的包被液了 毕竟ELISA也就是检测方法 不值当我们为了这样一个实验来反复摸索优化耗时太多 可以像试剂公司购买专门用于PI比较低的抗原的ELISA包被液 先跟他们讲清楚咱的蛋白PI是5 要做ELISA 要他们推荐一种适用于低PI的蛋白效果好的包被液 可以先要求给个试用装试试 好用再买 不好用或者不给就换一家‘ 试剂公司嘛现在满地都是 祝你好运了 |
6楼2011-04-30 16:51:09
gongeleven
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