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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 转化后涂平板不长菌
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阳光雨露118

新虫 (正式写手)

[求助] 转化后涂平板不长菌 已有2人参与

问题：目的片段连接PE2载体后转BL-21感受态细胞后涂板不长菌


本人操作过程：
连接
连接体系:线性化克隆载体：0.5微升
                         目的片段（1000-1500bp）: 1.5微升
             Enzyme  Premix: 5微升
                          纯水      ：3微升
体系配成后，轻轻混匀各组分，至于50度（pcr仪定温）反应15分钟，至于冰上冷却5分钟，存于负20度冰箱

转化:负70度取100微升BL-21感受态细胞至于冰上解冻2分钟，加入连接反应冷却液，轻轻混匀，至于冰上30分钟，42度热激1分30秒，冰水浴2分钟，加入600微升LB培养基，37摄氏度孵育10分钟充分复苏，37度200转每分钟摇45分钟，6000转离心8分钟，（超净工作台）留100微升培养液吸吹混匀涂板，37度培养箱过夜。


谢谢
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1楼 2016-09-26 19:24:09
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科学小覃

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kuaile5420: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-09-26 22:12:42
阳光雨露118: 金币+5, ★有帮助 2016-09-28 10:57:21
BL21转化率本来就不高，连接转化建议先转克隆菌株（如DH5a），提取质粒再转BL21
赞一下(1人) 回复此楼
生物科学
2楼2016-09-26 20:14:24
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
阳光雨露118: 金币+5, ★有帮助 2016-09-28 10:57:38
BL21转化率很低，平常的氯化钙法化转有可能导不进去，获得不了重组子，你可以考虑电转，效率会高很多
赞一下 回复此楼
···
3楼2016-09-27 16:49:50
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阳光雨露118

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 科学小覃 at 2016-09-26 20:14:24
BL21转化率本来就不高，连接转化建议先转克隆菌株（如DH5a），提取质粒再转BL21

我怎么给你金币？
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4楼2016-09-28 10:28:29
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阳光雨露118

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小冀- at 2016-09-27 16:49:50
BL21转化率很低，平常的氯化钙法化转有可能导不进去，获得不了重组子，你可以考虑电转，效率会高很多

我怎么给你金币？
赞一下 回复此楼
5楼2016-09-28 10:30:58
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科学小覃

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 阳光雨露118 at 2016-09-28 10:28:29
我怎么给你金币？...

互相帮助而已
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生物科学
6楼2016-09-28 20:06:06
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药娘子

新虫 (小有名气)
楼主，你好！请问你后来是怎样处理的

发自小木虫IOS客户端
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7楼2017-03-05 08:48:26
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