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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR没有目的条带，引物二聚体很明显
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1257851289

新虫 (小有名气)

[求助] PCR没有目的条带，引物二聚体很明显 已有1人参与

程序是95℃5min     95℃30s   60℃30s    72℃5min   32个循环    72℃延伸7min，目的条带4200bp，第一次很亮，后来带就不明显了，送原液测序不行，现在带都没了。求助该怎么改进

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1楼 2016-07-19 17:26:38
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1257851289

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by MMCCBB at 2016-07-20 22:10:45
建议买Super HiFi 酶试试 使用98℃的反应
...

我只是本科实习生，师姐给用啥就用啥

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7楼2016-07-20 22:21:20
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lvshilu

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-08-12 22:32:55
您好！PCR的问题向来号称最简单也最复杂。您这种情况，从您“第一次很亮”的描述来看，引物是匹配的，条件是可以的，后面重复实验扩不出来，则有可能是引物降解、模板降解、酶活失效等原因。个人认为模板降解的可能性最大。
但是如果“第一次很亮”是一种赝像，那您就需要仔细排查引物的设计，扩增条件的设定，模板的质量等所有体系因素了。通常的，换引物比较常见；扩增不出来时，降低退火温度到50℃也是可以尝试的；当然，模板的质量还是要讨论的，可以跑下胶，测下浓度什么的。通常酶失活的情况少见，但有条件的话，找一管阳性的酶试试，说不定有帮助呢。
总之，要设计对比实验对各种因素排查，有问题可以再交流。祝好运！
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1257851289
需要金币
2楼2016-07-20 16:58:53
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1257851289

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by lvshilu at 2016-07-20 16:58:53
您好！PCR的问题向来号称最简单也最复杂。您这种情况，从您“第一次很亮”的描述来看，引物是匹配的，条件是可以的，后面重复实验扩不出来，则有可能是引物降解、模板降解、酶活失效等原因。个人认为模板降解的可能 ...

嗯嗯。谢谢，我仔细找找原因

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3楼2016-07-20 20:06:19
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MMCCBB

新虫 (著名写手)
你选择哪个公司的酶，叫什么？有没有其它PCR仪，可以换个PCR仪试试。

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4楼2016-07-20 20:21:31
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