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小二郎

铜虫 (初入文坛)

[求助] 紧急求助~PCR产物电泳条带,特别奇怪,LZ好崩溃,,跪求各位提供帮助已有2人参与

各位好~~小妹新手在此求助
打算做qPCR标准品,现在用qPCR引物做普通PCR,扩增条件95℃8min,(95℃ 30s /55℃ 30S / 72℃ 30S )35个循环,72 10min,体系takra premix Taq(Ex taq verson 2.0)10u /正反引物(10mM)各1u/模版1u,电泳条带有两条,还算清晰,但并不是目的条带,其实目的条带只有100多bp, 条带居然有1000多bp,提高退火温度到60℃,条带也是这样的,空白对照除了引物并没有其它条带,请各位帮忙分析下原因,有没有人遇到这种情况?  还有一开始以为是引物合成错了,重新合成了一份,条带依然是这样的,我实在没辙了,,引物是采用文献里面的,很多外文文献都用过。。。。我的模版DNA是海水全基因组DNA
  附电泳图  marker是DL2000
图1 胶孔依次是marker/sample1/blank
图2 胶孔依次是marker/sample1/sample2

紧急求助~PCR产物电泳条带,特别奇怪,LZ好崩溃,,跪求各位提供帮助
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紧急求助~PCR产物电泳条带,特别奇怪,LZ好崩溃,,跪求各位提供帮助-1
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zhangjingwjs

新虫 (小有名气)

你确定Dna模版没有被污染吗,怎么感觉被细菌DNA污染了呢,所以才会有1000多的条带

发自小木虫IOS客户端
2楼2015-11-11 20:42:02
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小二郎

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangjingwjs at 2015-11-11 20:42:02
你确定Dna模版没有被污染吗,怎么感觉被细菌DNA污染了呢,所以才会有1000多的条带

我的样品是环境样品,不是纯菌株样品,DNA模版是是环境微生物基因组,,,被污染了才会有1000多的条带是什么因果关系?
3楼2015-11-11 20:45:29
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我爱罗的风沙

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓 2015-11-11 22:58:02
楼主你好。你看你从基因组里面P出了很多条带,但是没有目的条带,这说明了一个事实:你设计的引物的特异性不够好,所以才能P出非特异性的条带。目的条带没有P出来,可能是因为:①退火温度不正确,虽然说是要TM减5-10度,但是具体温度需要自己摸索,建议拉一个温度梯度。②楼主之后72度 10分钟我认为这是不正确的,可以尝试循环后保持4度或者直接取出产物。
Kyle, Ph.D Candidate. Dep.Basic medical science,School of Medicine, Tsinghua University. Beijing, China,PostCode:100084
4楼2015-11-11 22:18:23
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zhangjingwjs

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 小二郎 at 2015-11-11 20:45:29
我的样品是环境样品,不是纯菌株样品,DNA模版是是环境微生物基因组,,,被污染了才会有1000多的条带是什么因果关系?...

sorry理解错了,可能是引物特异性不行导致

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5楼2015-11-11 23:47:18
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zhangjingwjs

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 小二郎 at 2015-11-11 20:45:29
我的样品是环境样品,不是纯菌株样品,DNA模版是是环境微生物基因组,,,被污染了才会有1000多的条带是什么因果关系?...

sorry理解错了,可能是引物特异性不行导致

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6楼2015-11-11 23:48:54
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534720018

至尊木虫 (著名写手)

你的引物是自己设计的还是用的别人文献里的?...

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7楼2015-11-11 23:52:04
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zhrmghg人民

铜虫 (小有名气)

如果其他没有问题的话,建议你自己设计引物吧,qrt-pcr蛮好设计的啊,普通pcr那个72℃10分可以加上的

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相信自己!
8楼2015-11-12 08:57:50
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9楼2015-11-12 11:59:11
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qinqqjiajia

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
楼主重新设计引物吧,特异性太差,p出来的是别的东西呢
10楼2015-11-12 13:21:30
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