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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 紧急求助~PCR产物电泳条带，特别奇怪，LZ好崩溃，，跪求各位提供帮助
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小二郎

铜虫 (初入文坛)

[求助] 紧急求助~PCR产物电泳条带，特别奇怪，LZ好崩溃，，跪求各位提供帮助 已有2人参与

各位好~~小妹新手在此求助
打算做qPCR标准品，现在用qPCR引物做普通PCR，扩增条件95℃8min，（95℃ 30s /55℃ 30S / 72℃ 30S ）35个循环，72 10min，体系takra premix Taq（Ex taq verson 2.0）10u /正反引物（10mM）各1u/模版1u，电泳条带有两条，还算清晰，但并不是目的条带，其实目的条带只有100多bp, 条带居然有1000多bp,提高退火温度到60℃，条带也是这样的，空白对照除了引物并没有其它条带，请各位帮忙分析下原因，有没有人遇到这种情况？  还有一开始以为是引物合成错了，重新合成了一份，条带依然是这样的，我实在没辙了，，引物是采用文献里面的，很多外文文献都用过。。。。我的模版DNA是海水全基因组DNA
  附电泳图  marker是DL2000
图1 胶孔依次是marker/sample1/blank
图2 胶孔依次是marker/sample1/sample2

紧急求助~PCR产物电泳条带，特别奇怪，LZ好崩溃，，跪求各位提供帮助
图片1.jpg


紧急求助~PCR产物电泳条带，特别奇怪，LZ好崩溃，，跪求各位提供帮助-1
图片2.jpg
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1楼 2015-11-11 20:33:40
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zhangjingwjs

新虫 (小有名气)
你确定Dna模版没有被污染吗，怎么感觉被细菌DNA污染了呢，所以才会有1000多的条带

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2楼2015-11-11 20:42:02
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小二郎

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangjingwjs at 2015-11-11 20:42:02
你确定Dna模版没有被污染吗，怎么感觉被细菌DNA污染了呢，所以才会有1000多的条带

我的样品是环境样品，不是纯菌株样品，DNA模版是是环境微生物基因组，，，被污染了才会有1000多的条带是什么因果关系？
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3楼2015-11-11 20:45:29
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我爱罗的风沙

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓 2015-11-11 22:58:02
楼主你好。你看你从基因组里面P出了很多条带，但是没有目的条带，这说明了一个事实：你设计的引物的特异性不够好，所以才能P出非特异性的条带。目的条带没有P出来，可能是因为：①退火温度不正确，虽然说是要TM减5-10度，但是具体温度需要自己摸索，建议拉一个温度梯度。②楼主之后72度 10分钟我认为这是不正确的，可以尝试循环后保持4度或者直接取出产物。
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Kyle, Ph.D Candidate. Dep.Basic medical science，School of Medicine, Tsinghua University. Beijing, China,PostCode:100084
4楼2015-11-11 22:18:23
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zhangjingwjs

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小二郎 at 2015-11-11 20:45:29
我的样品是环境样品，不是纯菌株样品，DNA模版是是环境微生物基因组，，，被污染了才会有1000多的条带是什么因果关系？...

sorry理解错了，可能是引物特异性不行导致

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5楼2015-11-11 23:47:18
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zhangjingwjs

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小二郎 at 2015-11-11 20:45:29
我的样品是环境样品，不是纯菌株样品，DNA模版是是环境微生物基因组，，，被污染了才会有1000多的条带是什么因果关系？...

sorry理解错了，可能是引物特异性不行导致

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6楼2015-11-11 23:48:54
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534720018

至尊木虫 (著名写手)
你的引物是自己设计的还是用的别人文献里的？...

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7楼2015-11-11 23:52:04
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zhrmghg人民

铜虫 (小有名气)
如果其他没有问题的话，建议你自己设计引物吧，qrt-pcr蛮好设计的啊，普通pcr那个72℃10分可以加上的

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相信自己！
8楼2015-11-12 08:57:50
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277795
9楼2015-11-12 11:59:11
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qinqqjiajia

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主重新设计引物吧，特异性太差，p出来的是别的东西呢
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10楼2015-11-12 13:21:30
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