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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 做了好久的实验PCR一直没有结果，不知道问题出在哪了？？
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jingxialai

新虫 (初入文坛)

[求助] 做了好久的实验PCR一直没有结果，不知道问题出在哪了？？ 已有6人参与

PCR反应条件：98度预变性2min，94度15秒，退火温度做了梯度中间四孔的温度依次为：57度、59度、60.2度、62.6度，15秒，72度1min，总共30个循环，左右两边为DL5000和DL2000，目的条带为1355bp,可是胶却是这个样子，谢谢大家给点建议！！

做了好久的实验PCR一直没有结果，不知道问题出在哪了？？
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1楼 2016-06-26 16:50:02
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

永远一片天

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-06-27 07:43:07
xn8008: 应助指数+1 2016-06-27 08:07:58
jingxialai: 金币+3, ★★★很有帮助 2016-06-27 13:40:31
你这种情况有两种，第一，引物不好，非特异性带强烈，建议更换引物。第二，膜板不好，有可能你的基因组降解，或者杂质太多，这种情况建议重新提取基因组，并且最好用TE缓冲液保存，不要用纯水，基因组很容易降解，你的基因组中可能混有其它基因组。
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2楼2016-06-26 17:51:16
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viki_MDK

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by jingxialai at 2016-06-27 19:23:58
老板让自己出钱做实验，他没有课题不肯出钱了，读不下去的感觉...

你老板也太那个了，，一般招硕士就有培养经费的，就算没有课题。不行的话，，找其他老师联培，你帮其他老师做课题，又能保证你毕业。
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13楼2016-06-28 08:35:44
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mlxmiao

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-06-27 07:43:32
xn8008: 应助指数+1 2016-06-27 08:08:03
jingxialai: 金币+1, ★有帮助 2016-06-27 13:50:24
1.引物多设计几条，可以用在线软件（如下）。
2.72度1分钟，时间不够，1335bp的约要90秒，一般酶是1kb/min（特殊酶除外）
http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer

http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

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3楼2016-06-26 20:17:56
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mlxmiao

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

还有一条，30循环可能太少了，

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4楼2016-06-27 07:45:53
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18986641153

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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虽然你的目的片断扩出来特异性不好，但是你还是可以做切胶回收和TA克隆，应该还可以做出来的！

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做人，做事，做学问！！！
5楼2016-06-27 09:57:08
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jingxialai

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 永远一片天 at 2016-06-26 17:51:16
你这种情况有两种，第一，引物不好，非特异性带强烈，建议更换引物。第二，膜板不好，有可能你的基因组降解，或者杂质太多，这种情况建议重新提取基因组，并且最好用TE缓冲液保存，不要用纯水，基因组很容易降解，你 ...

谢谢！！引物设计了4对，之前一直做什么带都没有，现在终于有了，试剂盒给的参照一直也没有做出来，试剂盒药品用完了就这次出条带，提取的RNA，反转录的cDNA都是用无RNA酶的水溶解保存的。
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6楼2016-06-27 13:43:11
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jingxialai

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by mlxmiao at 2016-06-26 20:17:56
1.引物多设计几条，可以用在线软件（如下）。
2.72度1分钟，时间不够，1335bp的约要90秒，一般酶是1kb/min（特殊酶除外）
http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer
http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/prim ...

谢谢！！我试试，循环数太少，老板又说太多，哎好愁人
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7楼2016-06-27 13:51:10
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viki_MDK

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
什么模板，建议提供的信息多一点，这样的情况我觉得你的酶可能有问题，，建议用新的酶，感觉酶活不够
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8楼2016-06-27 15:46:30
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jingxialai

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by viki_MDK at 2016-06-27 15:46:30
什么模板，建议提供的信息多一点，这样的情况我觉得你的酶可能有问题，，建议用新的酶，感觉酶活不够

我自己提取的RNA做为模板反转录后PCR，可是反转录试剂盒提供的参照都没有做出条带，时间盒买回来在冰箱放了大半年，不知道有没有问题
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9楼2016-06-27 16:34:02
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viki_MDK

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by jingxialai at 2016-06-27 16:34:02
我自己提取的RNA做为模板反转录后PCR，可是反转录试剂盒提供的参照都没有做出条带，时间盒买回来在冰箱放了大半年，不知道有没有问题...

对照都没做出来，当然说明有问题，，建议用新的。
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10楼2016-06-27 17:12:41
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