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jingxialai

新虫 (初入文坛)

[求助] 做了好久的实验PCR一直没有结果,不知道问题出在哪了?? 已有6人参与

PCR反应条件:98度预变性2min,94度15秒,退火温度做了梯度中间四孔的温度依次为:57度、59度、60.2度、62.6度,15秒,72度1min,总共30个循环,左右两边为DL5000和DL2000,目的条带为1355bp,可是胶却是这个样子,谢谢大家给点建议!!

做了好久的实验PCR一直没有结果,不知道问题出在哪了??
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jingxialai

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 永远一片天 at 2016-06-26 17:51:16
你这种情况有两种,第一,引物不好,非特异性带强烈,建议更换引物。第二,膜板不好,有可能你的基因组降解,或者杂质太多,这种情况建议重新提取基因组,并且最好用TE缓冲液保存,不要用纯水,基因组很容易降解,你 ...

谢谢!!引物设计了4对,之前一直做什么带都没有,现在终于有了,试剂盒给的参照一直也没有做出来,试剂盒药品用完了就这次出条带,提取的RNA,反转录的cDNA都是用无RNA酶的水溶解保存的。
6楼2016-06-27 13:43:11
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查看全部 18 个回答

永远一片天

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-06-27 07:43:07
xn8008: 应助指数+1 2016-06-27 08:07:58
jingxialai: 金币+3, ★★★很有帮助 2016-06-27 13:40:31
你这种情况有两种,第一,引物不好,非特异性带强烈,建议更换引物。第二,膜板不好,有可能你的基因组降解,或者杂质太多,这种情况建议重新提取基因组,并且最好用TE缓冲液保存,不要用纯水,基因组很容易降解,你的基因组中可能混有其它基因组。
2楼2016-06-26 17:51:16
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mlxmiao

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-06-27 07:43:32
xn8008: 应助指数+1 2016-06-27 08:08:03
jingxialai: 金币+1, 有帮助 2016-06-27 13:50:24
1.引物多设计几条,可以用在线软件(如下)。
2.72度1分钟,时间不够,1335bp的约要90秒,一般酶是1kb/min(特殊酶除外)
http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer

http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

发自小木虫Android客户端
3楼2016-06-26 20:17:56
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mlxmiao

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

还有一条,30循环可能太少了,

发自小木虫Android客户端
4楼2016-06-27 07:45:53
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