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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 在做环介导等温扩增lamp，有些想法和问题想和大家交流请教一下，请前辈们多多指教~
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暴力曹

银虫 (初入文坛)

[求助] 在做环介导等温扩增lamp，有些想法和问题想和大家交流请教一下，请前辈们多多指教~

这段时间在做这方面的实验，有些问题有些不明白，请各位多指教~
问题一，引物是直接在线网页版设计的，开始用PCR仪做的温度梯度，在61~65这个范围扩增效果都很好，反应1h；前期在干浴锅上65反应1h就能明显看到沉淀，电泳条带也不错，但后来这段时间要么经常扩不出来，或者是需要延长扩增时间才可以，体系条件是完全一样的，而且从61到65都试过，有点疑惑。这种情况是什么原因，酶是新的，内引物也是隔一段时间就更新，会不会是因为外引物时间长了造成的？
问题二，关于反应结果的判定，用SYBR Green I做染色剂，在反应结束后加入观察荧光，这个做的还比较顺利，就是想可不可以在实验一开始就加入染料，然后直接反应结束观察荧光情况就好，这样可以避免污染，不知道可不可行，改天做个实验看看；
问题三，关于钙黄绿素做染色剂，和氯化锰都是直接从生工拿的国产的，便宜得很，但效果还可以，问题其实和一有点相同，就是现在反应时间要90min才能明显反应产生荧光，会不会是这两个试剂对酶活有影响，造成反应减慢？这里面还有个小教训分享一下，一般DNA是用水溶的，当时为了更长时间保存，用TE溶解的，结果反应体系每次在加入模板后就立马有荧光了，很囧，折腾了好久才想到原因。。。
问题四，在nature的文章里看到体系又加甜菜碱和tween20，我现在的体系都没加这两种，其作用大么？
问题五，环引物是不是会提高扩增速度，具体该怎么设计？
有点多，诸位大神多指教~
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无心亦心 自在观真
1楼 2014-07-01 15:49:44
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暴力曹

银虫 (初入文坛)
好的，谢谢~
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无心亦心 自在观真
2楼2014-07-04 12:22:08
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hooyawang

铜虫 (小有名气)
同学你好，我也在做关于LAMP方面的实验，我想问一下您的钙黄绿素和甜菜碱从哪个公司买的，可以把链接发给我吗？
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LAMP
3楼2014-08-21 16:32:48
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郑传益

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hooyawang at 2014-08-21 16:32:48
同学你好，我也在做关于LAMP方面的实验，我想问一下您的钙黄绿素和甜菜碱从哪个公司买的，可以把链接发给我吗？

同求，1410928287
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满足等于堕落
4楼2015-04-25 02:26:45
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玲玲在人间

铁虫 (小有名气)
加好所有的体系后，吧显色剂点在PCR管盖上，反应后李欣或者甩几下就行的，我的实验是过一段时间（1各月左右）就出现假阳性，怀疑是不是外引物太长造成的，另外，我的4条引物是混合在一起保存的，这样引物之间会不会自连或者造成引物的不稳定，液相得到相关抓也人员的解答，谢谢
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5楼2015-05-09 14:07:09
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施施施施施

新虫 (初入文坛)
请问楼主用钙黄绿素做出结果了么？我最近也在做这一方面，可是一直没结果。楼主做出来的话，能把体系分享下么？谢谢
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6楼2016-03-25 17:13:30
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wzc次

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 施施施施施 at 2016-03-25 17:13:30
请问楼主用钙黄绿素做出结果了么？我最近也在做这一方面，可是一直没结果。楼主做出来的话，能把体系分享下么？谢谢

你好，请问你用钙黄绿素做的结果怎么样？我最近也准备用这个做。请教一下
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7楼2017-02-16 17:10:47
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LAMP007

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
1楼: Originally posted by 暴力曹 at 2014-07-01 15:49:44
这段时间在做这方面的实验，有些问题有些不明白，请各位多指教~
问题一，引物是直接在线网页版设计的，开始用PCR仪做的温度梯度，在61~65这个范围扩增效果都很好，反应1h；前期在干浴锅上65反应1h就能明显看到沉淀 ...

想请教一下为什么我加入了SYBR green I稀释到100×的加入后，在紫外灯下有引物都会显色，你是怎么加入，阴性没有颜色的。

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8楼2017-09-10 23:16:01
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15112009180

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by LAMP007 at 2017-09-10 23:16:01
想请教一下为什么我加入了SYBR green I稀释到100×的加入后，在紫外灯下有引物都会显色，你是怎么加入，阴性没有颜色的。
...

你的SYBRgreen浓度太低了

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9楼2017-10-14 15:16:11
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15112009180

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 15112009180 at 2017-10-14 15:16:11
你的SYBRgreen浓度太低了
...

SYBRGREENl可能被污染了

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10楼2017-10-14 15:18:15
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