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在做环介导等温扩增lamp，有些想法和问题想和大家交流请教一下，请前辈们多多指教~
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这段时间在做这方面的实验，有些问题有些不明白，请各位多指教~ 问题一，引物是直接在线网页版设计的，开始用PCR仪做的温度梯度，在61~65这个范围扩增效果都很好，反应1h；前期在干浴锅上65反应1h就能明显看到沉淀，电泳条带也不错，但后来这段时间要么经常扩不出来，或者是需要延长扩增时间才可以，体系条件是完全一样的，而且从61到65都试过，有点疑惑。这种情况是什么原因，酶是新的，内引物也是隔一段时间就更新，会不会是因为外引物时间长了造成的？ 问题二，关于反应结果的判定，用SYBR Green I做染色剂，在反应结束后加入观察荧光，这个做的还比较顺利，就是想可不可以在实验一开始就加入染料，然后直接反应结束观察荧光情况就好，这样可以避免污染，不知道可不可行，改天做个实验看看； 问题三，关于钙黄绿素做染色剂，和氯化锰都是直接从生工拿的国产的，便宜得很，但效果还可以，问题其实和一有点相同，就是现在反应时间要90min才能明显反应产生荧光，会不会是这两个试剂对酶活有影响，造成反应减慢？这里面还有个小教训分享一下，一般DNA是用水溶的，当时为了更长时间保存，用TE溶解的，结果反应体系每次在加入模板后就立马有荧光了，很囧，折腾了好久才想到原因。。。 问题四，在nature的文章里看到体系又加甜菜碱和tween20，我现在的体系都没加这两种，其作用大么？ 问题五，环引物是不是会提高扩增速度，具体该怎么设计？ 有点多，诸位大神多指教~ |
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