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玉露金风

新虫 (初入文坛)

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[交流] 荧光定量PCR引物问题已有7人参与

这是某个基因引物的溶解曲线图，从图看，引物能用么？

IMG_20160608_190839.jpg

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1楼 2016-06-20 22:24:51

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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)

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你这是引物的溶解曲线吗？就我所知道的荧光定量PCR中引物的好坏是要检测产物的溶解曲线吧，这样才能衡量引物在你PCR体系里扩增的特异性。而且最好是看你所有的孔中的溶解曲线Tm值是否一致，如果有的孔好，有的孔不好，也是不能用的。
如果这是产物的溶解曲线，我一般做的正常的有变性、退火、延伸的程序（楼上说的两部发我不清楚）要求产物大小在100以上的话，似乎没有见过你这么低的Tm值，一般都是80多度。

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3楼2016-06-21 09:28:59

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查看全部 8 个回答

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆不喜欢发脾气

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰·手有余香，谢谢你的理解与支持。祝您科研顺利，文章多多。 2016-06-21 00:00:47

1) 至今不太清楚Melt Curve里Tm值和特异性的关系，但据我观察，qRT-PCR引物一般都会设计在60度以上以保证特异性，同时有些PCR程序直接以两步发进行，这些引物扩增的产物经过melt curve后基本峰值都会70左右及以上。这可能也与扩增长度有关，总之一般单峰，且峰形呈现"Sharp“特性，就可以了(除非全是引物二聚体，一般这种非特异产物的Tm在melt curve里均会在50~60左右，且峰值不够“Sharp”，比较好判别)
2) 跑一下胶，看看条带大小也能断定。

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