菌株：一株放线菌  基因组GC含量较高，68.5%。
前期想通过重叠延伸PCR把上下游同源臂连起来，但一直没有目的条带，后面重新设计了一次引物，但只能扩增出引物二聚体，这期间用了TaKaRa的 LA taq with GC buffer、EmeraldAmp® PCR Master Mix以及全式金的TransStart® FastPfu DNA Polymerase 结果都是要么没有条带要么都是引物二聚体，体系都是25ul，也尝试过加入DMSO 也不行，但这个菌的16S用上述酶都能扩增出来。
后来考虑到重叠延伸PCR引物的酶切修饰  重叠部分  可能对二聚体、扩增有影响，就随便从基因组上挑选了一个片段用oligo设计了一个评分都很好的引物（见图），也blast过特异性，引物合成单上Tm值都是63度左右，就想验证一下我这个菌到底能不能扩增片段
图片1中 左边第一道是提取基因组   DL5000 MARKER（从下往上是100、200 500、750bp）左边是FastPfu 体系25ul（引物 0.2uM 模板 150ng  酶0.5ul   1*PCR stimulant 用于扩增富含GC/复杂模板）。程序：98度3min、98度20s、从左到右退火温度（67、63、60、55）30s、72度30s，、72度5min。 marker右边四道是将1*PCR stimulant 换成8%DMSO ,体系和上面一样 25ul，程序、退火温度也同上述一直。 没有任何目标条带，预期产物500bp     只有最下面两条不知道是什么   
后来看到DMSO需要改进引物浓度。   就又了配置一次体系  图2左边两道是阴阳性对照（阳性16S），marker中间的三条道为 FastPfu聚合酶（2%DMSO、0.2uM）（6%DMSO、0.6uM）（10%DMSO、0.8uM），未加PCR stimulant ，程序同上，用了56度退火温度 。 右边三道为TAKARA的EX taq酶，体系程序同上(60度退火温度)，还是只有下面两条带，没有预期500bp条带

电泳是1%gel

我现在怀疑是我扩增区域模板形成了稳定的二级结构，引物根本没有和目的区域结合

有没有大神告诉一下我该怎么办

这几天的辛酸历程  写的有点乱  有什么不懂得我在补充


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