| 查看: 4644 | 回复: 14 | |||
| 【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者 华农食品123 的 2 个金币 ，回帖就立即获得 1 个金币，每人有 1 次机会 | |||
[交流]
PCR扩增不出条带，救救孩子吧
|
|||
|
菌株：一株放线菌 基因组GC含量较高，68.5%。 前期想通过重叠延伸PCR把上下游同源臂连起来，但一直没有目的条带，后面重新设计了一次引物，但只能扩增出引物二聚体，这期间用了TaKaRa的 LA taq with GC buffer、EmeraldAmp® PCR Master Mix以及全式金的TransStart® FastPfu DNA Polymerase 结果都是要么没有条带要么都是引物二聚体，体系都是25ul，也尝试过加入DMSO 也不行，但这个菌的16S用上述酶都能扩增出来。 后来考虑到重叠延伸PCR引物的酶切修饰 重叠部分 可能对二聚体、扩增有影响，就随便从基因组上挑选了一个片段用oligo设计了一个评分都很好的引物（见图），也blast过特异性，引物合成单上Tm值都是63度左右，就想验证一下我这个菌到底能不能扩增片段  图片1中 左边第一道是提取基因组 DL5000 MARKER（从下往上是100、200 500、750bp）左边是FastPfu 体系25ul（引物 0.2uM 模板 150ng 酶0.5ul 1*PCR stimulant 用于扩增富含GC/复杂模板）。程序：98度3min、98度20s、从左到右退火温度（67、63、60、55）30s、72度30s，、72度5min。 marker右边四道是将1*PCR stimulant 换成8%DMSO ,体系和上面一样 25ul，程序、退火温度也同上述一直。 没有任何目标条带，预期产物500bp 只有最下面两条不知道是什么 后来看到DMSO需要改进引物浓度。 就又了配置一次体系 图2左边两道是阴阳性对照（阳性16S），marker中间的三条道为 FastPfu聚合酶（2%DMSO、0.2uM）（6%DMSO、0.6uM）（10%DMSO、0.8uM），未加PCR stimulant ，程序同上，用了56度退火温度 。 右边三道为TAKARA的EX taq酶，体系程序同上(60度退火温度)，还是只有下面两条带，没有预期500bp条带 电泳是1%gel 我现在怀疑是我扩增区域模板形成了稳定的二级结构，引物根本没有和目的区域结合 有没有大神告诉一下我该怎么办 这几天的辛酸历程 写的有点乱 有什么不懂得我在补充  IMG_20200909_122537.jpg  IMG_20200909_180514.jpg  8ST~NIKA{DGZHX{}F7(P_UP.png |
回复此楼» 猜你喜欢
WRN变构抑制剂HRO761：从D1/D2界面锁定到MSI合成致死的工具化合物深度解析
已经有0人回复
-
KRAS G12V(ON) 选择性抑制剂 RMC-5127：从三元复合物机制到科研应用
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有204人回复
-
SHP2 变构抑制剂 Sitneprotafib：从作用机制到科研试剂选型要点
已经有0人回复
-
PRMT5·MTA 抑制剂 MRTX1719 的科研应用
已经有0人回复
-
SW033291 科研使用解析：分子特征、储存与实验获取要点
已经有0人回复
-
泛 RAS 抑制新思路：大环肽拟似物如何同时牵住突变型与野生型 RAS？
已经有0人回复
-
TYK2/JAK1 双靶点工具化合物 Brepocitinib：激酶选择性、研究进展与实验应用全解析
已经有0人回复
-
矢车菊素-3-O-葡萄糖苷质控实录：从一张HPLC图谱读懂纯度与稳定性
已经有0人回复
-
恩诺沙星（Enrofloxacin）科研解析：分子特征、LC-MS/MS 检测与实验室使用要点
已经有0人回复
-
Calderasib理化性质与实验操作技术笔记
已经有0人回复
2楼2020-09-10 14:02:25
3楼2020-09-10 19:12:33
junjieshao
禁虫 (小有名气)
★
华农食品123(金币+1): 谢谢参与
华农食品123(金币+1): 谢谢参与
|
本帖内容被屏蔽 |
4楼2020-09-11 04:24:01
5楼2020-09-11 14:23:54
6楼2020-09-11 14:27:00
junjieshao
禁虫 (小有名气)
|
本帖内容被屏蔽 |
7楼2020-09-11 22:01:00
8楼2020-09-12 09:08:54
10楼2020-09-12 22:17:06
12楼2020-09-14 14:07:19
13楼2020-09-23 09:28:15
简单回复
tzynew9楼
2020-09-12 18:53
回复
华农食品123(金币+1): 谢谢参与
miaojiabing11楼
2020-09-14 08:33
回复
华农食品123(金币+1): 谢谢参与
nono200914楼
2021-10-01 23:33
回复
华农食品123(金币+1): 谢谢参与
·
刀劈三关15楼
2021-10-04 21:36
回复
。
