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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩增不出条带，救救孩子吧
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华农食品123

新虫 (初入文坛)

[交流] PCR扩增不出条带，救救孩子吧

菌株：一株放线菌  基因组GC含量较高，68.5%。
前期想通过重叠延伸PCR把上下游同源臂连起来，但一直没有目的条带，后面重新设计了一次引物，但只能扩增出引物二聚体，这期间用了TaKaRa的 LA taq with GC buffer、EmeraldAmp® PCR Master Mix以及全式金的TransStart® FastPfu DNA Polymerase 结果都是要么没有条带要么都是引物二聚体，体系都是25ul，也尝试过加入DMSO 也不行，但这个菌的16S用上述酶都能扩增出来。
后来考虑到重叠延伸PCR引物的酶切修饰  重叠部分  可能对二聚体、扩增有影响，就随便从基因组上挑选了一个片段用oligo设计了一个评分都很好的引物（见图），也blast过特异性，引物合成单上Tm值都是63度左右，就想验证一下我这个菌到底能不能扩增片段
图片1中 左边第一道是提取基因组   DL5000 MARKER（从下往上是100、200 500、750bp）左边是FastPfu 体系25ul（引物 0.2uM 模板 150ng  酶0.5ul   1*PCR stimulant 用于扩增富含GC/复杂模板）。程序：98度3min、98度20s、从左到右退火温度（67、63、60、55）30s、72度30s，、72度5min。 marker右边四道是将1*PCR stimulant 换成8%DMSO ,体系和上面一样 25ul，程序、退火温度也同上述一直。 没有任何目标条带，预期产物500bp     只有最下面两条不知道是什么   
后来看到DMSO需要改进引物浓度。   就又了配置一次体系  图2左边两道是阴阳性对照（阳性16S），marker中间的三条道为 FastPfu聚合酶（2%DMSO、0.2uM）（6%DMSO、0.6uM）（10%DMSO、0.8uM），未加PCR stimulant ，程序同上，用了56度退火温度 。 右边三道为TAKARA的EX taq酶，体系程序同上(60度退火温度)，还是只有下面两条带，没有预期500bp条带

电泳是1%gel

我现在怀疑是我扩增区域模板形成了稳定的二级结构，引物根本没有和目的区域结合

有没有大神告诉一下我该怎么办

这几天的辛酸历程  写的有点乱  有什么不懂得我在补充

PCR扩增不出条带，救救孩子吧
IMG_20200909_122537.jpg


PCR扩增不出条带，救救孩子吧-1
IMG_20200909_180514.jpg


PCR扩增不出条带，救救孩子吧-2
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1楼 2020-09-09 20:25:13
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守望者047

金虫 (小有名气)
★
华农食品123(金币+1): 谢谢参与
目的条带不大的话，建议合成，节约时间。或者试试诺唯赞的pan mix

发自小木虫Android客户端
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2楼2020-09-10 14:02:25
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华农食品123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 守望者047 at 2020-09-10 14:02:25
目的条带不大的话，建议合成，节约时间。或者试试诺唯赞的pan mix

同源臂加起来差不多1200bp，就算这个合成，后面做PCR相关的实验还是不行。

目前觉得是模板自己形成稳定的二级结构，没有和引物结合。

今天试了先把模板变性再加入体系，扩出来条带  却不是我的预期大小
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3楼2020-09-10 19:12:33
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junjieshao

禁虫 (小有名气)
★
华农食品123(金币+1): 谢谢参与
本帖内容被屏蔽
4楼2020-09-11 04:24:01
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华农食品123

新虫 (初入文坛)
谢谢您的回复

我前期是想扩增同源臂的，然后SOE-PCR连起来

但后来一直扩不出来，换了引物也扩不出，后来考虑到重叠延伸PCR引物的酶切修饰  重叠部分  可能对二聚体、扩增有影响

所以就设计了一个评分较好，无任何修饰的引物  任何去扩增一段片段，看是否能成功

图中就是新引物的扩增结果    还是没有扩增条带，更没有我预期的条带（500bp）

现在就是不知道为什么，总感觉还是模板和引物没有结合的问题
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5楼2020-09-11 14:23:54
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华农食品123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by junjieshao at 2020-09-11 04:24:01
没看懂，
你是要先PCV扩增出上游和下游同源臂，然后融合PCR连起来？
现在是上下游同源臂PCR出不来？

回复您了，在五楼
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6楼2020-09-11 14:27:00
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junjieshao

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
7楼2020-09-11 22:01:00
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2011sp

铁杆木虫 (著名写手)
★
华农食品123(金币+1): 谢谢参与
引物Tm值太低了，设计80度的再做

发自小木虫Android客户端
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8楼2020-09-12 09:08:54
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华农食品123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by junjieshao at 2020-09-11 22:01:00
试过巢氏吗，可能模板量小。
菌的DNA使用试剂盒抽提的？16s可能丰度高容易PCR。...

巢式还没试过

基因组使用生工试剂盒提取的，浓度150ng/ul，A260/A280 2.0  

感觉还是引物的问题
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10楼2020-09-12 22:17:06
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
★
华农食品123(金币+1): 谢谢参与
Pfu扩增效率低，有时候Taq能扩增的片段，Pfu扩增不出来
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12楼2020-09-14 14:07:19
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zhouxfd

木虫 (正式写手)
★
华农食品123(金币+1): 谢谢参与
你这个是GC含量的问题，换一个酶就好了
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13楼2020-09-23 09:28:15
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tzynew9楼
2020-09-12 18:53   回复  
华农食品123(金币+1): 谢谢参与
miaojiabing11楼
2020-09-14 08:33   回复  
华农食品123(金币+1): 谢谢参与
nono200914楼
2021-10-01 23:33   回复  
华农食品123(金币+1): 谢谢参与
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刀劈三关15楼
2021-10-04 21:36   回复  
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