应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩增不出条带，救救孩子吧
51/1返回列表
查看: 2256  |  回复: 14
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者 华农食品123 的 2 个金币 ，回帖就立即获得 1 个金币，每人有 1 次机会
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

华农食品123

新虫 (初入文坛)

[交流] PCR扩增不出条带，救救孩子吧

菌株：一株放线菌  基因组GC含量较高，68.5%。
前期想通过重叠延伸PCR把上下游同源臂连起来，但一直没有目的条带，后面重新设计了一次引物，但只能扩增出引物二聚体，这期间用了TaKaRa的 LA taq with GC buffer、EmeraldAmp® PCR Master Mix以及全式金的TransStart® FastPfu DNA Polymerase 结果都是要么没有条带要么都是引物二聚体，体系都是25ul，也尝试过加入DMSO 也不行，但这个菌的16S用上述酶都能扩增出来。
后来考虑到重叠延伸PCR引物的酶切修饰  重叠部分  可能对二聚体、扩增有影响，就随便从基因组上挑选了一个片段用oligo设计了一个评分都很好的引物（见图），也blast过特异性，引物合成单上Tm值都是63度左右，就想验证一下我这个菌到底能不能扩增片段
图片1中 左边第一道是提取基因组   DL5000 MARKER（从下往上是100、200 500、750bp）左边是FastPfu 体系25ul（引物 0.2uM 模板 150ng  酶0.5ul   1*PCR stimulant 用于扩增富含GC/复杂模板）。程序：98度3min、98度20s、从左到右退火温度（67、63、60、55）30s、72度30s，、72度5min。 marker右边四道是将1*PCR stimulant 换成8%DMSO ,体系和上面一样 25ul，程序、退火温度也同上述一直。 没有任何目标条带，预期产物500bp     只有最下面两条不知道是什么   
后来看到DMSO需要改进引物浓度。   就又了配置一次体系  图2左边两道是阴阳性对照（阳性16S），marker中间的三条道为 FastPfu聚合酶（2%DMSO、0.2uM）（6%DMSO、0.6uM）（10%DMSO、0.8uM），未加PCR stimulant ，程序同上，用了56度退火温度 。 右边三道为TAKARA的EX taq酶，体系程序同上(60度退火温度)，还是只有下面两条带，没有预期500bp条带

电泳是1%gel

我现在怀疑是我扩增区域模板形成了稳定的二级结构，引物根本没有和目的区域结合

有没有大神告诉一下我该怎么办

这几天的辛酸历程  写的有点乱  有什么不懂得我在补充

PCR扩增不出条带，救救孩子吧
IMG_20200909_122537.jpg


PCR扩增不出条带，救救孩子吧-1
IMG_20200909_180514.jpg


PCR扩增不出条带，救救孩子吧-2
8ST~NIKA{DGZHX{}F7(P_UP.png
回复此楼

» 猜你喜欢

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼2020-09-09 20:25:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

华农食品123

新虫 (初入文坛)
谢谢您的回复

我前期是想扩增同源臂的，然后SOE-PCR连起来

但后来一直扩不出来，换了引物也扩不出，后来考虑到重叠延伸PCR引物的酶切修饰  重叠部分  可能对二聚体、扩增有影响

所以就设计了一个评分较好，无任何修饰的引物  任何去扩增一段片段，看是否能成功

图中就是新引物的扩增结果    还是没有扩增条带，更没有我预期的条带（500bp）

现在就是不知道为什么，总感觉还是模板和引物没有结合的问题
赞一下 回复此楼
5楼2020-09-11 14:23:54
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答

守望者047

金虫 (小有名气)
★
华农食品123(金币+1): 谢谢参与
目的条带不大的话，建议合成，节约时间。或者试试诺唯赞的pan mix

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
2楼2020-09-10 14:02:25
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

华农食品123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 守望者047 at 2020-09-10 14:02:25
目的条带不大的话，建议合成，节约时间。或者试试诺唯赞的pan mix

同源臂加起来差不多1200bp，就算这个合成，后面做PCR相关的实验还是不行。

目前觉得是模板自己形成稳定的二级结构，没有和引物结合。

今天试了先把模板变性再加入体系，扩出来条带  却不是我的预期大小
赞一下 回复此楼
3楼2020-09-10 19:12:33
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

junjieshao

禁虫 (小有名气)
★
华农食品123(金币+1): 谢谢参与
本帖内容被屏蔽
4楼2020-09-11 04:24:01
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答
提示: 如果您在30分钟内回复过其他散金贴，则可能无法领取此贴金币
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复(可上传附件) 论文翻译-EnPapers美助理教授团队-SCI英文润色
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 材料博士毕业 +3 112233ssg 2024-06-02 3/150 2024-06-03 09:59 by Lwyy1106
[基金申请] 前些天开会有个人见到人就搞关系，一查此人全是MDPI/Hindawi论文，鄙视! +11 zju2000 2024-06-02 11/550 2024-06-03 09:50 by gy116024
[论文投稿] EI学报，一审返修后，为啥不再送审，直接终审中? +4 qweasd12345 2024-05-27 7/350 2024-06-03 09:34 by caocao4735
[硕博家园] 实验室太吵闹，无法安静学习，怎么办？ +9 utahh 2024-05-31 16/800 2024-06-03 09:23 by caocao4735
[论文投稿] Scientific reports 投稿 +4 chencome12 2024-06-02 6/300 2024-06-03 09:13 by chencome12
[论文投稿] 选期刊 5+3 jfdhj 2024-05-29 5/250 2024-06-03 07:47 by 黑大环境队长
[基金申请] 2024杰青和万人领军什么时候会评 +6 墨香琴韵 2024-06-02 6/300 2024-06-03 07:24 by llhljsy
[硕博家园] 讨厌酒桌文化 +8 hahamyid 2024-05-31 8/400 2024-06-03 06:51 by dong5391
[教师之家] 博士高校求职 安建大vs西科大 +5 chengmy19 2024-06-01 13/650 2024-06-02 20:15 by chengmy19
[基金申请] 九部门发文：不得将专利授权数量作为人才评价、项目评审、职称评定、高校评价等的条件 +17 sjtu2012 2024-05-28 21/1050 2024-06-02 13:43 by 欢乐颂叶蓁
[论文投稿] 没收到邮件 10+4 荣小撇 2024-05-31 9/450 2024-06-02 13:25 by bobvan
[考研] 研0二导师分到新来的博士后靠谱吗 +7 sone9 2024-05-31 7/350 2024-06-01 19:10 by 梦燕园
[考博] 24年博士招生 +8 abinit432 2024-05-27 10/500 2024-06-01 17:38 by czp97
[论文投稿] 求Sci期刊推荐 10+4 甄小鱼 2024-05-30 7/350 2024-06-01 10:41 by bobvan
[基金申请] 数理的人才答辩通知发了吗 +7 yzy3327 2024-05-30 7/350 2024-06-01 09:15 by 撒哈拉西部
[高分子] MMA预聚体光固化发雾问题求助 +3 惠亚金总 2024-05-29 10/500 2024-05-31 14:59 by 惠亚金总
[文学芳草园] 对对子啊 +5 天若孤独 2024-05-29 7/350 2024-05-31 09:00 by wjykycg
[文学芳草园] 物是人非 +4 myrtle 2024-05-30 4/200 2024-05-30 15:05 by mapenggao
[论文投稿] 审稿专家比较坚定的让补充实验，但实在没法补充实验，修回还有希望吗？ (EPI+1) 3+3 qweasd12345 2024-05-29 6/300 2024-05-30 08:11 by qweasd12345
[基金申请] E05青基有几个评审 +4 KYXY123 2024-05-28 4/200 2024-05-28 19:25 by popt2t
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭