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华农食品123

新虫 (初入文坛)

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[交流] PCR扩增不出条带，救救孩子吧

菌株：一株放线菌基因组GC含量较高，68.5%。
前期想通过重叠延伸PCR把上下游同源臂连起来，但一直没有目的条带，后面重新设计了一次引物，但只能扩增出引物二聚体，这期间用了TaKaRa的 LA taq with GC buffer、EmeraldAmp® PCR Master Mix以及全式金的TransStart® FastPfu DNA Polymerase 结果都是要么没有条带要么都是引物二聚体，体系都是25ul，也尝试过加入DMSO 也不行，但这个菌的16S用上述酶都能扩增出来。
后来考虑到重叠延伸PCR引物的酶切修饰重叠部分可能对二聚体、扩增有影响，就随便从基因组上挑选了一个片段用oligo设计了一个评分都很好的引物（见图），也blast过特异性，引物合成单上Tm值都是63度左右，就想验证一下我这个菌到底能不能扩增片段

图片1中左边第一道是提取基因组 DL5000 MARKER（从下往上是100、200 500、750bp）左边是FastPfu 体系25ul（引物 0.2uM 模板 150ng 酶0.5ul 1*PCR stimulant 用于扩增富含GC/复杂模板）。程序：98度3min、98度20s、从左到右退火温度（67、63、60、55）30s、72度30s，、72度5min。 marker右边四道是将1*PCR stimulant 换成8%DMSO ,体系和上面一样 25ul，程序、退火温度也同上述一直。没有任何目标条带，预期产物500bp 只有最下面两条不知道是什么

后来看到DMSO需要改进引物浓度。就又了配置一次体系图2左边两道是阴阳性对照（阳性16S），marker中间的三条道为 FastPfu聚合酶（2%DMSO、0.2uM）（6%DMSO、0.6uM）（10%DMSO、0.8uM），未加PCR stimulant ，程序同上，用了56度退火温度。右边三道为TAKARA的EX taq酶，体系程序同上(60度退火温度)，还是只有下面两条带，没有预期500bp条带

电泳是1%gel

我现在怀疑是我扩增区域模板形成了稳定的二级结构，引物根本没有和目的区域结合

有没有大神告诉一下我该怎么办

这几天的辛酸历程写的有点乱有什么不懂得我在补充

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1楼 2020-09-09 20:25:13

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华农食品123

新虫 (初入文坛)

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谢谢您的回复

我前期是想扩增同源臂的，然后SOE-PCR连起来

但后来一直扩不出来，换了引物也扩不出，后来考虑到重叠延伸PCR引物的酶切修饰重叠部分可能对二聚体、扩增有影响

所以就设计了一个评分较好，无任何修饰的引物任何去扩增一段片段，看是否能成功

图中就是新引物的扩增结果还是没有扩增条带，更没有我预期的条带（500bp）

现在就是不知道为什么，总感觉还是模板和引物没有结合的问题