最近在从巨噬细胞中提取蛋白，提出蛋白后用BCA测定蛋白浓度，但是只有0.8mg/ml左右，不知道该怎么办，求各位大神指点一下。
具体操作步骤如下：
先是铺板后给药，提蛋白前细胞已经特别密集的分布到六孔板中有些甚至叠起来。
1.细胞用培养基吹打下来，收集细胞悬液1000rpm离心5分钟（因为要提总蛋白包括膜蛋白没就没用胰酶消化）。
2.用预冷的PBS洗涤细胞2次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3.每孔加入150μl RIPA裂解液（临用前加入PMSF，终浓度为1mM）混匀，转入96孔板中4℃震荡30分钟。
4.14000rpm离心10分钟。将上清快速吸入预冷的干净EP管中（注意不要吸到沉淀）。
5.BCA测定蛋白浓度。
我这样提取出来的浓度最大也就0.8mg/ml,后来每孔加100ul的 RIPA裂解液甚至两个孔加100ul的RIPA裂解液浓度也一直上不来。不知道是什么原因，都快要愁死了。。。RIPA裂解液我是用的碧云天的 P0013B，强的裂解液，含有20mM Tris (pH7.5)， 150mM NaCl， 1% Triton X-100，以及sodium pyrophosphate， β-
glycerophosphate， EDTA， Na3VO4， leupeptin等多种抑制剂。说是有蛋白酶抑制剂，磷酸酯酶抑制剂。
求各位大神指点一下。。。。。 返回小木虫查看更多