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巨噬细胞RAW264.7细胞提取蛋白浓度低，该怎么办
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最近在从巨噬细胞中提取蛋白，提出蛋白后用BCA测定蛋白浓度，但是只有0.8mg/ml左右，不知道该怎么办，求各位大神指点一下。 具体操作步骤如下： 先是铺板后给药，提蛋白前细胞已经特别密集的分布到六孔板中有些甚至叠起来。 1.细胞用培养基吹打下来，收集细胞悬液1000rpm离心5分钟（因为要提总蛋白包括膜蛋白没就没用胰酶消化）。 2.用预冷的PBS洗涤细胞2次，每次洗涤后尽可能吸干上清。 3.每孔加入150μl RIPA裂解液（临用前加入PMSF，终浓度为1mM）混匀，转入96孔板中4℃震荡30分钟。 4.14000rpm离心10分钟。将上清快速吸入预冷的干净EP管中（注意不要吸到沉淀）。 5.BCA测定蛋白浓度。 我这样提取出来的浓度最大也就0.8mg/ml,后来每孔加100ul的 RIPA裂解液甚至两个孔加100ul的RIPA裂解液浓度也一直上不来。不知道是什么原因，都快要愁死了。。。RIPA裂解液我是用的碧云天的 P0013B，强的裂解液，含有20mM Tris (pH7.5)， 150mM NaCl， 1% Triton X-100，以及sodium pyrophosphate， β- glycerophosphate， EDTA， Na3VO4， leupeptin等多种抑制剂。说是有蛋白酶抑制剂，磷酸酯酶抑制剂。 求各位大神指点一下。。。。。 |
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zd1984hero
铁杆木虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
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779233023: 金币+10, 博学EPI+1, ★★★很有帮助 2016-01-13 22:16:27
779233023: 金币+10, 博学EPI+1, ★★★很有帮助 2016-01-13 22:16:27
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1. 不会破坏细胞，我用13000rpm 2. 不用转到96空板振，就放在tube中振，你的细胞就是裂解不好才浓度低的 发自小木虫IOS客户端 |
4楼2016-01-09 13:46:57
zd1984hero
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【答案】应助回帖
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我觉得主要是细胞裂解不充分，还有就是你加裂解液太多了30-50ｕl 即可！另外你收集细胞的时候离心速度大点10000rpm左右吧。裂解细胞时，用裂解液把tube中的细胞吹散（反复三十次），放至室温三十分钟，然后放到四度400-500rpm震荡，接下来的基本没什么问题！ 发自小木虫IOS客户端 |
2楼2016-01-08 21:32:19
3楼2016-01-08 21:43:30
5楼2016-01-13 22:16:59