| 查看: 2929 | 回复: 4 | ||
| 本帖产生 1 个 博学EPI ，点击这里进行查看 | ||
[求助]
巨噬细胞RAW264.7细胞提取蛋白浓度低，该怎么办
|
||
|
最近在从巨噬细胞中提取蛋白，提出蛋白后用BCA测定蛋白浓度，但是只有0.8mg/ml左右，不知道该怎么办，求各位大神指点一下。 具体操作步骤如下： 先是铺板后给药，提蛋白前细胞已经特别密集的分布到六孔板中有些甚至叠起来。 1.细胞用培养基吹打下来，收集细胞悬液1000rpm离心5分钟（因为要提总蛋白包括膜蛋白没就没用胰酶消化）。 2.用预冷的PBS洗涤细胞2次，每次洗涤后尽可能吸干上清。 3.每孔加入150μl RIPA裂解液（临用前加入PMSF，终浓度为1mM）混匀，转入96孔板中4℃震荡30分钟。 4.14000rpm离心10分钟。将上清快速吸入预冷的干净EP管中（注意不要吸到沉淀）。 5.BCA测定蛋白浓度。 我这样提取出来的浓度最大也就0.8mg/ml,后来每孔加100ul的 RIPA裂解液甚至两个孔加100ul的RIPA裂解液浓度也一直上不来。不知道是什么原因，都快要愁死了。。。RIPA裂解液我是用的碧云天的 P0013B，强的裂解液，含有20mM Tris (pH7.5)， 150mM NaCl， 1% Triton X-100，以及sodium pyrophosphate， β- glycerophosphate， EDTA， Na3VO4， leupeptin等多种抑制剂。说是有蛋白酶抑制剂，磷酸酯酶抑制剂。 求各位大神指点一下。。。。。 |
回复此楼» 猜你喜欢
329求调剂
已经有6人回复
-
286求调剂
已经有3人回复
-
349求调剂
已经有4人回复
-
324求调剂
已经有6人回复
-
333求调剂
已经有6人回复
-
311求调剂
已经有5人回复
-
一志愿武汉理工，总分321，英一数二，求老师收留。
已经有3人回复
-
317求调剂
已经有4人回复
-
一志愿华理，数一英一285求A区调剂
已经有10人回复
-
化学308分求调剂
已经有4人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 用氧化低密度脂蛋白诱导巨噬细胞RAW264.7泡沫化没有造模成功，怎么办？
已经有6人回复
- 我想检测两株菌（一个野生型，一个突变株）在巨噬细胞raw264.7中的存活能力是否有差别
已经有8人回复
- 巨噬细胞选择 想探究样品对巨噬细胞氧化损伤保护作用 RAW264.7 还是J774A.1 还是Ana.1
已经有3人回复
- RAW264.7小鼠巨噬细胞血清需要热灭活吗？
已经有5人回复
- 脂多糖(LPS) 诱导巨噬细胞系 RAW 264.7细胞模型是急慢性炎症研究的通用体外模型吗？
已经有0人回复
- 急切寻求帮助。RAW264.7巨噬细胞
已经有8人回复
- 用LPS刺激RAW264.7巨噬细胞系来建立炎症反应模型，LPS从哪里能买到？
已经有2人回复
- ”巨噬细胞系 RAW264.7“中的“RAW264.7”是什么含义？
已经有1人回复
- 急需小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7
已经有0人回复
- 求助哪位帅哥美女那有小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7啊？
已经有2人回复
- 【求助/交流】巨噬细胞RAW264.7复苏
已经有0人回复
- 【求助】RAW264.7、J774.1和正常小鼠巨噬细胞Ana-1的区别
已经有21人回复
zd1984hero
铁杆木虫 (正式写手)
- 博学EPI: 1
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 5950.3
- 散金: 2003
- 红花: 3
- 帖子: 789
- 在线: 359.2小时
- 虫号: 1427362
- 注册: 2011-10-04
- 性别: GG
- 专业: 细胞衰老
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
779233023: 金币+10, 博学EPI+1, ★★★很有帮助 2016-01-13 22:16:27
779233023: 金币+10, 博学EPI+1, ★★★很有帮助 2016-01-13 22:16:27
|
1. 不会破坏细胞，我用13000rpm 2. 不用转到96空板振，就放在tube中振，你的细胞就是裂解不好才浓度低的 发自小木虫IOS客户端 |
4楼2016-01-09 13:46:57
zd1984hero
铁杆木虫 (正式写手)
- 博学EPI: 1
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 5950.3
- 散金: 2003
- 红花: 3
- 帖子: 789
- 在线: 359.2小时
- 虫号: 1427362
- 注册: 2011-10-04
- 性别: GG
- 专业: 细胞衰老
【答案】应助回帖
|
我觉得主要是细胞裂解不充分，还有就是你加裂解液太多了30-50ｕl 即可！另外你收集细胞的时候离心速度大点10000rpm左右吧。裂解细胞时，用裂解液把tube中的细胞吹散（反复三十次），放至室温三十分钟，然后放到四度400-500rpm震荡，接下来的基本没什么问题！ 发自小木虫IOS客户端 |
2楼2016-01-08 21:32:19
3楼2016-01-08 21:43:30
5楼2016-01-13 22:16:59
