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质粒PCR产物片段大小问题

作者 梧桐柒夕: 来源: 小木虫 750 15 举报帖子

质粒为pUC57的大肠杆菌，质粒提取用的是自制试剂盒，经电泳过后确定是pUC57，然后用的是50μl的Taq体系进行的PCR扩增，引物自设的，将产物进行电泳时发现有两种不同的情况。其一是得到了400+的片段（此片段为正常片段），但同时做的相关平行组还得到了6000左右的片段。有没有相关PCR通透者可以解释一下，这个6000左右的片段会产生的原因？以及这个6000的片段是否正常？返回小木虫查看更多

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hailunl

有非特异性很正常，PCR不能说明问题。
例如，引物特异性不好，或者退火温度过低，延伸时间过长都会出现非特异性条带，
只要有目标条带就可以了。
如果你想再检测，建议提高退火温度，质粒为模板，退火温度高点没事；延伸时间掌控在目标条带范围；另外，模板稀释10倍或50倍。
Neo2000

你这个载体多大，是不是转了一圈了？这种事常有
梧桐柒夕

引用回帖:
2楼: Originally posted by hailunl at 2014-06-08 19:11:00
有非特异性很正常，PCR不能说明问题。
例如，引物特异性不好，或者退火温度过低，延伸时间过长都会出现非特异性条带，
只要有目标条带就可以了。
如果你想再检测，建议提高退火温度，质粒为模板，退火温度高点没 ...

所有条件都是设计好的，已经是最优的了，如上述说的，部分组出现的是正常地，另一组出现的差异性很大，所以，想知道，在这个过程中，出现这么大片段的原因，是想知道，在怎样的情况下会出现这种情况，是所有产物连在一起了么？
梧桐柒夕

引用回帖:
3楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-08 19:35:27
你这个载体多大，是不是转了一圈了？这种事常有

载体是2710bp的。
梧桐柒夕

引用回帖:
3楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-08 19:35:27
你这个载体多大，是不是转了一圈了？这种事常有

难道转了两圈？
hailunl

引用回帖:
4楼: Originally posted by 梧桐柒夕 at 2014-06-08 21:52:47
所有条件都是设计好的，已经是最优的了，如上述说的，部分组出现的是正常地，另一组出现的差异性很大，所以，想知道，在这个过程中，出现这么大片段的原因，是想知道，在怎样的情况下会出现这种情况，是所有产物连 ...

如果加上目标基因长度只有2.7k，扩出6k的非特异性条带，不可能什么转不转了两圈的。
很有可能是引物，水，或者酶被污染。
hailunl

引用回帖:
4楼: Originally posted by 梧桐柒夕 at 2014-06-08 21:52:47
所有条件都是设计好的，已经是最优的了，如上述说的，部分组出现的是正常地，另一组出现的差异性很大，所以，想知道，在这个过程中，出现这么大片段的原因，是想知道，在怎样的情况下会出现这种情况，是所有产物连 ...

很明确告诉你，不可能是所有产物连在一起。什么转了一圈不一圈的，不要相信那些胡言乱语。我最讨厌不懂装懂。
你延伸时间多长扩出6K的片段？你延伸400左右的片段扩出这么长的，不可能转了一圈。
如果你真想找出原因，回收，测序，两端各测一个反应。测序时候把自己引物带上10ul
，