赤霉菌原生质体制备，制不出来，求大神帮助~~~急~~~
我最近一直在做赤霉菌原生质体制备，参考的是张文宣 赵南 朱江萍的赤霉素产生菌原生质体制备、纯化与再生工艺的研究，按照他的方法，配制2%纤维素酶，1%蜗牛酶和0.1%溶菌酶，用的溶液是高渗溶液（0.7M NaCl），酶液用0.2μm水系滤膜过滤待用。
做过（1）赤霉菌平板上的菌丝直接加到酶液中放在30℃恒温箱中酶解（适当振荡），每隔0.5h用油镜观察。
（2）液体培养基培养24h后，用4层擦镜纸过滤得孢子悬液，7000rpm离心10min之后，用高渗溶液洗涤2次之后，用高渗溶液重悬，取一定量到酶液中放在30℃恒温箱中酶解（适当振荡），由于放在载玻片上不能使液体干了之后观察，加入香柏油之后油镜观察看到圆形物质，学长说是气泡，所以直接用相差显微镜观察，每隔0.5h观察，观察了5h都没有发现圆形或球形。。。
（3）所以我以为是酶液的浓度不够，还有孢子的细胞壁比菌丝的细胞壁厚，我配制了4%纤维素酶，2%蜗牛酶，重复上述步骤，还是观察不到原生质体。。。
（上述都在无菌环境下进行）
不知道是什么原因，请大神指点迷津，万分感激！！！
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京公网安备 11010802022153号
我之前做的油镜观察到的形态，不知道是原生质体，还是水泡，望大神指点~
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我看过这方面的资料，但自己还没开始做，不过看了你的操作，可以给你一点建议：
1. 菌丝采用对数期菌丝，培养24h可能有点短，你要保证开始有足够的菌丝量（用新鲜菌丝比活化的孢子好些，可以多培养几瓶，镜检菌丝形态确定）；
2. 4层擦镜纸过滤，可能太厚了，因为真菌无论菌丝还是孢子都比较粗大，我们平常过滤放线菌也就用2层擦镜纸，你用4层，可能收集到的菌丝量会很少（可以对滤液进行镜检确定一下），过滤前，可以加入玻璃珠对菌丝振荡一下，将菌丝打成片段，这样肯那个会好些；
3. 赤霉菌本身在40倍下即可观察，其原生质体直径应该比菌丝直径大些，所以你用相差显微镜在40倍下应该就可以清楚观察到，不必使用油镜（避免油中水泡干扰）。
4.实在不确定，你就放到高渗再生平板上，看能否再生。
一些建议，希望对你有帮助。
40倍观察，不必等水干再观察，你用盖玻片压一下，用相差观察也可以的。
那请问酶液用什么溶液配啊，如果用高渗溶液配，怎么调节pH？本来想用缓冲液配制的，不过把处理好的菌液加进去，得到的原生质体可能会涨破，请问我该怎么做？
还有之前做的为什么制备不出？用擦镜纸过滤之后还是有好多孢子的，是酶液没有活性的问题吗？还是什么？
请问酶液怎么配制，如果用高渗溶液配制，怎么调节pH？本来准备用缓冲液配制，可又怕处理处理好的菌液加入酶液中制备出的原生质体涨破。。。
还有我分析不出是哪里出了问题，用四层擦镜纸过滤得到的孢子悬液浓度也很高的，在显微镜下可以观察到，是酶液出问题了嘛？
酶液就用生理盐水就可以了，反正你洗菌丝用的就是生理盐水，即使1:1，还是生理盐水的浓度，制备的原生质体不会破掉的。
至于你说的一直看不到原生质体，你可以正常镜检看下孢子或者菌丝多不多，如果孢子或菌丝仍然很多，那很可能是酶体系的问题。
你可以自己从多方面考虑，先找找问题所在。
我用的是高渗溶液呢，难道是pH，酶解时间，温度或者酶液浓度的问题？