其实步骤和双酶切是一样的。知识两个酶的反应温度和Buffer不一样，需要分步进行。

建议楼主这样做：
在第一次酶切后用胶回收试剂盒或者PCR产物纯化试剂盒将你所要的大小一致的片段回收回来，然后对所回收的产物进行第二次酶切，酶切后用同样的方法姜产物回收回来。建议您用NEB公司的酶，TaKaRa公司的酶有些时候不好使，不稳定。
     另外，如果有可以共用Buffer的，也可以试一试，我的经验是双酶切虽然节省时间，但是经常切不开或者酶切的不完全。影响下一步的反应。如果时间允许的话，尽量用分布酶切，这样虽然时间要长一些，但是可以提高效率，防止实验材料的浪费。
     最后，提醒楼主一点，分步酶切的时候因为每一步都有少许样品的损失，所以一定要准备充足的样品。一般是正常样品量的1.5倍，

同意楼上的~

第一次酶切完后可以用纯化试剂盒回收，或乙醇沉淀，第二次酶切回收要看酶切片段大小了，切下不用的那段片段小的话就可以纯化回收，大的话要胶回收，都有相应的试剂盒

如果分步酶切的话，最好准备足量的质粒或目的片段。
在酶切中，如果有一个酶的效率很低的，就先用效率低酶大量的切，然后胶回收已切开片段，再用效率高的酶切，这样的话，可以在很大程度上降低空载或假阳性率

尤其是当你切得两个酶切位点很近（比如都在多克隆位点上），看不到切下来的小片段时，最好先用低效的切