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【求助】请问用荧光FITC标记BSA 的操作步骤

作者 cherish2287
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请问用荧光FITC标记BSA 的操作步骤
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  • 精华评论
  • cpumantiszj

    FITC就是荧光素的羧基活化酯,与氨基很容易连接的,有点类似于EDC or DCC/NHS缩合体系对羧基的催化,还有你可以查查FITC试剂盒说明书,上面有操作步骤,我觉得你就把FITC和BSA放在缓冲盐溶液中室温搅拌2h就可以了。

  • aegeansyang

    查FITC说明书, 或去pierce网站看看

  • travelerchem

    4度,避光,搅拌24h。反应很容易进行,麻烦的如何纯化,去除未反应的染料。

  • luyaozju

    引用回帖:
    Originally posted by travelerchem at 2009-4-2 10:16:
    4度,避光,搅拌24h。反应很容易进行,麻烦的如何纯化,去除未反应的染料。

    可以用葡聚糖凝胶柱去除游离FITC
    或者是直接透析也行

  • xuaner12

    引用回帖:
    Originally posted by travelerchem at 2009-4-2 10:16:
    4度,避光,搅拌24h。反应很容易进行,麻烦的如何纯化,去除未反应的染料。

    你好,能具体跟我说一下除去FITC 的实验方法?谢谢啊。
         我的邮箱pangxinforever@126.com

  • huquan0_0

    这个简单  你买哪个 FITC异硫氰酸酯,
    这个异硫氰酸荧光素反应的条件大致在9的时候比较好,所以你要配碳酸钠缓冲溶液
    过柱麻烦 透析吧



    参考资料
    FITC标记抗体流程
    (1)将待交联的蛋白(浓度³1mg/ml)对交联反应液透析三次4 ℃,至pH=9.0。交联反应液配制方法:7.56g NaHCO3,1.06g Na2CO3,7.36g NaCl,加水定容至1 L。
    (2) 将FITC溶于DMSO中,浓度为1mg/ml。每次交联使用的FITC均应新鲜配制,避光。
    (3) 按P:F(蛋白质:FITC)=1mg:150μg 的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中,边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀,暗处4 ℃反应8 hr。
    (4) 加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L, 4 ℃终止反应2 hr。
    (5) 将交联物在PBS中透析四次以上,至透析液清亮。
    (6) 交联物的鉴定

    F/P比例:  ,该值应介于2.5 ~ 6.5之间。
    (7) FITC交联的蛋白应置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中,加入0.1% NaN3、1% BSA,4℃暗处保存。
    FITC标记抗体流程
    (一) 原理
      目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下FITC的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合,标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光,通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。
      (二) 操作步骤
        将纯化的IgG抗体对PH9~9.5碳酸盐缓冲液透析过夜,
    透析后抗体液移入小烧杯中
                  ↓
        称取适量IFTC,加入二甲亚砜(DMSO)(FITC~1mg/1ml DMSO)
           使终浓度为1mgFITC/1mlDMSO
            FITC/IgG比例:如IgG浓度为1mg/ml,FITC/IgG比例约为50μgFITC/mgIgG;
        如IgG为5~10mg/ml,则比例为25μgFITC/ml IgG
           在10ml小烧杯中先放入抗体
                  ↓
        按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中
               ↓
        将标记物用PBS加至2.5ml,磁力搅拌器室温下避光搅拌2h
               ↓
        用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素,先用25ml PBS淋洗G25柱
               ↓
        收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰,测定F/P
        比值。第二个荧光素峰为游离荧光素
        计算:
           
        合适的F/P值为2~4。
      (三) 试剂器材
      1. 纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。
      2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。
      3. PBS、DMSO
      4. PH9~9.5碳酸盐缓冲液: Na2CO34.3g,NaHCO3 8.6g加蒸馏水至500ml。
      5. PD10柱(Sephadex G25柱)
      6. 磁力搅拌器,紫外分光光度计等
      (四) 注意事项
      1. FITC保存于4℃暗处,使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取,以避免潮解。
      2. FITC-DMSO液要临用时配制。
      3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制,

  • xuaner12

    引用回帖:
    Originally posted by luyaozju at 2009-4-3 12:01:

    可以用葡聚糖凝胶柱去除游离FITC
    或者是直接透析也行

    你好,能详细和我说一下,去除有力的FITC 的具体的步骤吗?谢谢啊 。
    我的邮箱是pangxinforever@126.com

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