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【求助】请问用荧光FITC标记BSA 的操作步骤
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急急急急 请问用荧光FITC标记BSA 的操作步骤 高人指点阿。 万分感激！！！ |
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5楼2009-04-03 12:01:37
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你好，能具体跟我说一下除去FITC 的实验方法？谢谢啊。 我的邮箱pangxinforever@126.com |
6楼2009-10-31 22:31:22
huquan0_0
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这个简单 你买哪个 FITC异硫氰酸酯， 这个异硫氰酸荧光素反应的条件大致在9的时候比较好，所以你要配碳酸钠缓冲溶液 过柱麻烦 透析吧 参考资料 FITC标记抗体流程 （1）将待交联的蛋白（浓度³1mg/ml）对交联反应液透析三次4 ℃，至pH＝9.0。交联反应液配制方法：7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3，7.36g NaCl，加水定容至1 L。 （2） 将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/ml。每次交联使用的FITC均应新鲜配制，避光。 （3） 按P:F（蛋白质：FITC）=1mg:150μg 的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4 ℃反应8 hr。 （4） 加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L， 4 ℃终止反应2 hr。 （5） 将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。 （6） 交联物的鉴定 F/P比例: ，该值应介于2.5 ~ 6.5之间。 （7） FITC交联的蛋白应置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1% NaN3、1% BSA，4℃暗处保存。 FITC标记抗体流程 (一) 原理 目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下FITC的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。 (二) 操作步骤 将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜， 透析后抗体液移入小烧杯中 ↓ 称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO) 使终浓度为1mgFITC／1mlDMSO FITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFITC／mgIgG； 如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／ml IgG 在10ml小烧杯中先放入抗体 ↓ 按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中 ↓ 将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h ↓ 用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素，先用25ml PBS淋洗G25柱 ↓ 收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P 比值。第二个荧光素峰为游离荧光素 计算: 合适的F／P值为2～4。 (三) 试剂器材 1. 纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。 2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。 3. PBS、DMSO 4. PH9～9.5碳酸盐缓冲液: Na2CO34.3g，NaHCO3 8.6g加蒸馏水至500ml。 5. PD10柱(Sephadex G25柱) 6. 磁力搅拌器，紫外分光光度计等 (四) 注意事项 1. FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。 2. FITC-DMSO液要临用时配制。 3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。 |
7楼2009-11-01 18:21:28
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你好，能详细和我说一下，去除有力的FITC 的具体的步骤吗？谢谢啊 。 我的邮箱是pangxinforever@126.com |
8楼2009-11-02 09:32:37
fyw921
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9楼2009-11-05 09:53:55
