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cherish2287

[交流] 【求助】请问用荧光FITC标记BSA 的操作步骤

急急急急
请问用荧光FITC标记BSA 的操作步骤
高人指点阿。
万分感激！！！
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1楼2009-04-01 16:31:44
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cpumantiszj

木虫 (小有名气)
★ ★
yusen_1982(金币+1,VIP+0):欢迎讨论 4-2 11:52
薰衣草儿(金币+1,VIP+0):再加一个 11-1 10:25
FITC就是荧光素的羧基活化酯，与氨基很容易连接的，有点类似于EDC or DCC/NHS缩合体系对羧基的催化，还有你可以查查FITC试剂盒说明书，上面有操作步骤，我觉得你就把FITC和BSA放在缓冲盐溶液中室温搅拌2h就可以了。
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2楼2009-04-02 09:30:10
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aegeansyang

银虫 (正式写手)
查FITC说明书， 或去pierce网站看看
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3楼2009-04-02 10:14:06
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travelerchem

至尊木虫 (知名作家)
★
yusen_1982(金币+1,VIP+0):欢迎应助 4-2 11:52
4度，避光，搅拌24h。反应很容易进行，麻烦的如何纯化，去除未反应的染料。
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4楼2009-04-02 10:16:39
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luyaozju

金虫 (小有名气)
★
wgcui(金币+1,VIP+0):谢谢 4-7 11:51
引用回帖:
Originally posted by travelerchem at 2009-4-2 10:16:
4度，避光，搅拌24h。反应很容易进行，麻烦的如何纯化，去除未反应的染料。

可以用葡聚糖凝胶柱去除游离FITC
或者是直接透析也行
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5楼2009-04-03 12:01:37
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xuaner12

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
薰衣草儿(金币+0,VIP+0):欢迎讨论~ 11-1 10:26
引用回帖:
Originally posted by travelerchem at 2009-4-2 10:16:
4度，避光，搅拌24h。反应很容易进行，麻烦的如何纯化，去除未反应的染料。

你好，能具体跟我说一下除去FITC 的实验方法？谢谢啊。
     我的邮箱pangxinforever@126.com
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6楼2009-10-31 22:31:22
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huquan0_0

捐助贵宾 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
yusen_1982(金币+1,VIP+0):欢迎讨论 11-1 18:24
yusen_1982(金币+1,VIP+0):欢迎讨论 11-1 18:46
这个简单  你买哪个 FITC异硫氰酸酯，
这个异硫氰酸荧光素反应的条件大致在9的时候比较好，所以你要配碳酸钠缓冲溶液
过柱麻烦 透析吧



参考资料
FITC标记抗体流程
（1）将待交联的蛋白（浓度³1mg/ml）对交联反应液透析三次4 ℃，至pH＝9.0。交联反应液配制方法：7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3，7.36g NaCl，加水定容至1 L。
（2） 将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/ml。每次交联使用的FITC均应新鲜配制，避光。
（3） 按P:F（蛋白质：FITC）=1mg:150μg 的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4 ℃反应8 hr。
（4） 加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L， 4 ℃终止反应2 hr。
（5） 将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。
（6） 交联物的鉴定

F/P比例:  ，该值应介于2.5 ~ 6.5之间。
（7） FITC交联的蛋白应置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1% NaN3、1% BSA，4℃暗处保存。
FITC标记抗体流程
(一)　原理
　　目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下FITC的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。
　　(二)　操作步骤
　　　　将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，
透析后抗体液移入小烧杯中
　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO)
　      使终浓度为1mgFITC／1mlDMSO
        FITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFITC／mgIgG；
　　　　如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／ml IgG
　      在10ml小烧杯中先放入抗体
　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中
　　　　　　　　　　　↓
　　　　将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h
　　　　　　　　　　　↓
　　　　用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素，先用25ml PBS淋洗G25柱
　　　　　　　　　　　↓
　　　　收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P
　　　　比值。第二个荧光素峰为游离荧光素
　　　　计算:
　　　　　　　
　　　　合适的F／P值为2～4。
　　(三)　试剂器材
　　1.　纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。
　　2.　FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。
　　3.　PBS、DMSO
　　4.　PH9～9.5碳酸盐缓冲液: Na2CO34.3g，NaHCO3 8.6g加蒸馏水至500ml。
　　5.　PD10柱(Sephadex G25柱)
　　6.　磁力搅拌器，紫外分光光度计等
　　(四)　注意事项
　　1.　FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。
　　2.　FITC-DMSO液要临用时配制。
　　3.　碳酸盐缓冲液要新鲜配制。
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海纳百川有容乃大；自强不息止于至善。
7楼2009-11-01 18:21:28
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xuaner12

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
薰衣草儿(金币+1,VIP+0):鼓励新虫子 11-2 16:01
引用回帖:
Originally posted by luyaozju at 2009-4-3 12:01:

可以用葡聚糖凝胶柱去除游离FITC
或者是直接透析也行

你好，能详细和我说一下，去除有力的FITC 的具体的步骤吗？谢谢啊 。
我的邮箱是pangxinforever@126.com
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8楼2009-11-02 09:32:37
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fyw921

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by cherish2287 at 2009-4-1 16:31:
急急急急
请问用荧光FITC标记BSA 的操作步骤
高人指点阿。
万分感激！！！

楼主，您好！请问你制定出FITC标记BSA的方法了没有！如果得到结果了，发我一份实验方案好吗！我的实验也需要用到BSA-FITC,购买成品的太贵，导师不同意，要我自己制备，谢谢你提供帮助！
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9楼2009-11-05 09:53:55
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