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[交流] 【求助】请问用荧光FITC标记BSA 的操作步骤

急急急急
请问用荧光FITC标记BSA 的操作步骤
高人指点阿。
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1楼2009-04-01 16:31:44

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huquan0_0

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yusen_1982(金币+1,VIP+0):欢迎讨论 11-1 18:46

这个简单  你买哪个 FITC异硫氰酸酯，
这个异硫氰酸荧光素反应的条件大致在9的时候比较好，所以你要配碳酸钠缓冲溶液
过柱麻烦透析吧

参考资料
FITC标记抗体流程
（1）将待交联的蛋白（浓度³1mg/ml）对交联反应液透析三次4 ℃，至pH＝9.0。交联反应液配制方法：7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3，7.36g NaCl，加水定容至1 L。
（2）将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/ml。每次交联使用的FITC均应新鲜配制，避光。
（3）按P:F（蛋白质：FITC）=1mg:150μg 的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4 ℃反应8 hr。
（4）加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L， 4 ℃终止反应2 hr。
（5）将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。
（6）交联物的鉴定

F/P比例:  ，该值应介于2.5 ~ 6.5之间。
（7） FITC交联的蛋白应置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1% NaN3、1% BSA，4℃暗处保存。
FITC标记抗体流程
(一)　原理
　　目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下FITC的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。
　　(二)　操作步骤
　　　　将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，
透析后抗体液移入小烧杯中
　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO)
　    使终浓度为1mgFITC／1mlDMSO
      FITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFITC／mgIgG；
　　　　如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／ml IgG
　    在10ml小烧杯中先放入抗体
　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中
　　　　　　　　　　　↓
　　　　将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h
　　　　　　　　　　　↓
　　　　用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素，先用25ml PBS淋洗G25柱
　　　　　　　　　　　↓
　　　　收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P
　　　　比值。第二个荧光素峰为游离荧光素
　　　　计算:
　　　　　　　
　　　　合适的F／P值为2～4。
　　(三)　试剂器材
　　1.　纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。
　　2.　FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。
　　3.　PBS、DMSO
　　4.　PH9～9.5碳酸盐缓冲液: Na2CO34.3g，NaHCO3 8.6g加蒸馏水至500ml。
　　5.　PD10柱(Sephadex G25柱)
　　6.　磁力搅拌器，紫外分光光度计等
　　(四)　注意事项
　　1.　FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。
　　2.　FITC-DMSO液要临用时配制。
　　3.　碳酸盐缓冲液要新鲜配制。