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急！单酶切为何出现多条带？

作者 lybio: 来源: 小木虫 400 8 举报帖子

用EcorIII进行单酶切重组质粒（确定只有一个此酶切位点，而且质粒用其他酶切，得到对的相应条带），反应体系10ul：酶0.5ul，质粒3ul，buffer 1ul，灭菌DD水 5.5ul ，37度过夜酶切，结果电泳出现4个条带，其中有一条只有400bp，而且条带很宽，不解是什么原因？希望得到大家的帮助，谢谢！返回小木虫查看更多

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精华评论

pph0259

质粒不纯的可能性较大；
lybio

用试剂盒提的，应该纯度可以保证，而且用双酶切条带正确
lingyu20071001

可能没有完全切开，建议加1ul酶试试
xxh8372

这个应该是外源片断含有这个酶的酶切位点

当然具体也不是很好分析，强烈建议上一个图

另外还没有介绍外缘片断的大小，等等
十比

没有完全切开，建议减少质粒的量，应该一微升就行啦。
lybio

EcorIII酶切位点是我特意通过重叠延伸PCR得到的酶切位点，可保证基因中没有这个酶切位点，且连接的是T simple 载体，没有其他酶切位点。昨天又做了此酶切，酶量加大到0.8ul，质粒3ul，还是出现多条带，纳闷。决定先去测个序看看
lybio

引用回帖:
Originally posted by 十比 at 2008-4-14 23:14:
没有完全切开，建议减少质粒的量，应该一微升就行啦。

1ul 会不会太少了，根本见不着条带
，