建立在胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）与同源重组技术基础之上的基因打靶技术(Gene targeting)是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段[1-3]。通过对生物遗传信息的定向修饰，并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，从而研究基因的功能，阐明生物体的遗传进化，疾病发生的分子机制，提供相关的疾病治疗药物、评价模型及新型预防、治疗疫苗等，是后基因组时代基因功能研究的重要技术手段。本文概述基因打靶的背景、原理、策略、生物学应用及问题与展望。
　一、基因打靶研究的背景
目前的基因转移技术，如显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀及逆转录病毒载体感染等方法，已能有效地将外源基因导入靶细胞内。但这些导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的，可能导致下面几种情况出现：①导入的外源基因整合入某一正常基因的中部，导致该正常基因表达的缺如；②导入的外源基因整合入细胞内正常基因的侧翼序列，影响了其周围正常基因的活性；③外源基因的导入有可能激活细胞内的原癌基因；④导入的外源基因由于其整合位点的不适，而在细胞内不表达或表达难以控制。为避免上述情况的出现，最好的途径就是将外源基因导入预先确定的位点。即对细胞内靶位点进行定点修饰——基因打靶，而研究该基因的功能或在生物发育中的作用。随着人类及四十多种微生物基因组测序的完成，发现了大量未知功能的基因，应用基因打靶技术对这些新基因进行靶向修饰，是研究其功能最直接最有效的手段。因此，基因打靶就日益成为继基因转移技术后亟待发展的新技术。
　二、基因打靶原理
生物界同源重组现象的发现，为基因打靶奠定了坚实的理论基础，而胚胎干细胞技术的发展，促进了基因打靶的广泛应用。同源重组(Homologous recombination)又称一般性重组或非特异性重组(General recombination)，是指相似的DNA交换遗传信息的过程, 外源DNA片段可与宿主基因组的相应片段发生交换（即重组）。早在20世纪初，Morgan等人通过对果蝇眼色遗传的分析揭示了同源染色体之间的DNA重组是产生交换的基础。1985年在哺乳动物细胞中实现了同源重组[4]。基因打靶通常是指用含已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术[5]。
ES细胞是一类具有在体外培养条件下保持未分化状态的增殖能力及分化为多种细胞类型的细胞。自从1981年美国的Gail[6]和英国的Evans等[7]分别成功地从发育中的小鼠囊胚的内细胞团（inner cell mass）分离出胚胎干细胞, 随后, 又从原始生殖细胞——一种最终分化为精或卵细胞的早期胚胎细胞中得到具有胚胎干细胞相似特性的细胞群，称为胚胎种系(embryonic germ，EG)细胞[8]。胚胎干细胞注入体内与完整胚胎形成嵌合体后，可以发育形成包括生殖细胞在内的一系列成体组织[9]；正是由于胚胎干细胞的特殊功能，ES细胞基因打靶技术已被广泛地应用于建立转基因动物之中。从80年代到90年代初，小鼠ES细胞基因打靶技术已发展到成熟阶段。1984年， Bradly等[10]成功地用显微注射法将ES细胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，获得生殖系嵌合体，经过适当的交配，获得了源于ES细胞系的纯系小鼠。此实验首次证实体外培养的ES细胞能在体内分化发育成生殖系嵌合体并可获得小鼠纯合体子代。1987年，人们利用ES细胞技术建立了次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)基因敲除(Gene knockout)的动物模型[11]。此后，这项技术得到了普遍应用和长足发展。
　三、打靶载体的构建
基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等非同源序列，其中同源序列是同源重组效率的关键因素。
基因打靶载体有基因插入型载体(Gene-insertion vector)和基因置换型载体(Gene—replacement vector)。插入型载体中与靶基因同源的区段中含有特异的酶切位点，线性化后，同源重组导致基因组序列的重复，从而干扰了目标基因的功能。置换型载体进行线性化的酶切位点在引导序列和筛选基因外侧，线性化后，同源重组使染色体DNA序列为打靶载体序列替换。大多数基因敲除突变都采用置换型载体进行基因打靶。
　四、外源DNA导人的方式
外源DNA导人的方式主要有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒法等。目前应用最广的是显微注射法。Capecchi报道，用显微注射法导入可得到很高的转染效率，占接受外源DNA细胞的10％~20％，但显微注射每次只能注射一个细胞，而电穿孔法可同时使许多细胞得到转染。Mansour等研究发现电穿孔可使1％的ES细胞稳定转染。逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细胞有特异的亲合力，可用于时空特异性基因打靶，在人类疾病的基因治疗方面具有较大的发展潜力[12]。
　　五、基因打靶的筛选方法
（1）正负双向选择系统(positive-negative-selection, PNS)
为了更好地筛选发生同源重组的克隆，1988年Mansour[13]等人设计了PNS, 解决了定点整合与随机整合的鉴别问题。同源重组时，只有载体的同源区以内部分发生重组，同源区以外部分将被切除。随机整合时，是在载体的两端将整个载体连入染色体内。置换型载体含有正负选择基因各一，正选择基因多为neo基因，位于同源区内，其在随机整合和同源重组中均可正常表达。负选择基因在靶基因同源区之外，位于载体的3’末端，常用HSV-tk基因，在同源重组时，tk基因将被切除而丢失，相反在随机整合时，所有的序列均保留（包括tk）。胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性核苷酸，而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。故同源重组时，G418和 GANC都有抗性，随机整合时对G418有抗性，但对GANC敏感，细胞将被杀死，无整合的将被G418杀死。用G418作正筛选，选出含有neo基因的细胞株，再用丙氧鸟苷作负筛选淘汰含有tk基因的细胞株，保留未含有tk基因的同源重组细胞株。此方法是目前应用较广泛的一种策略。正向筛选标记基因 Neo具有双重作用，一方面导致靶基因的插入突变；同时作为重组细胞的正向筛选标志，该基因产物可使细胞在含有新霉素的培养基中生长。除了上述方法外，还可用PCR及Southern杂交法进一步筛选及鉴定中靶细胞。
常用的选择标记基因：正选择标记基因有新霉素磷酸转移酶（neo）、潮霉素B磷酸转移酶（hph）、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶（gpt）、次黄嘌呤磷酸转移酶（Hprt）、胸腺嘧啶激酶（tk）及嘌呤霉素乙酰转移酶（puro）。负选择标记基因有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶（HSV-tk）、SacB、rpsl（strA）、tetAR、pheS、thyA、CacY、gata-I、 ccdB等[14]。
（2）正相选择法（positive selection method）
麻省理工学院Sharp教授的研究组独辟新径，建立了一种新的同源重组选择方法—正相选择法[15]。这种选择法适用于在靶细胞内正常表达的基因的定点突变。其主要程序是：将选择标记基因 neor的启动子和起始密码剪切掉，再嵌合入打靶载体中与靶位点同源的序列内，将打靶载体转染进靶细胞，可能出现下面几种情况：①打靶载体不整合入靶细胞基因组，将随传代而丢失；②外源打靶序列随机整合，由于neor基因缺失了其自身的启动子和起始密码，整合位点周围亦无启动子，使neor基因的表达受阻；③虽是随机整合，但其整合位点侧翼序列在其它基因的启动子能启动neor基因的表达；④外源打靶载体与靶位点发生了同源重组，则neor基因可借助靶基因自然存在的其和起始密码的作用而呈现表达活性。因此，如用G418筛选，则抗性细胞中将只包含后两种可能情况，根据这两种情况下基因组DNA酶切图谱的不一致，用Southern印迹杂交即可检测出同源重组的克隆。
利用正相选择法，Sharp等对NIH/3T3细胞转化而来的MT-1.4细胞系中的癌基因pmt成功地进行了定点突变。之后不久，哥伦比亚大学的Schwartzberg等[16]用此方法也实现了另一种细胞癌基因c-abl在 ES细胞中的定点突变。最近，利用与正向选择法相似的原理，Jasin等[17]对小鼠T淋巴细胞系CD4位点亦成功地进行了定点突变。

六、基因打靶的策略
（一） 完全基因剔除(complete knotk-out)的策略
在ES细胞中进行基因打靶最常用的策略依然是使用PNS载体[13]。借助于阳性选择标记基因通常被插入靶基因功能最关键的外显子中[18，19]，或通过同源重组删除靶基因最重要的功能域[20]，实行靶基因的完全剔除。阳性选择标记基因常采用β-半乳糖苷酶基因（lacZ），将其以正确的读框插入靶基因的外显子中，除了剔除靶基因外，通过分析β-半乳搪苷酶的活性可以研究靶基因表达的时空顺序。 lacZ基因5’端若携带内源核糖体插入位点(internal ribosomal entry sites，IREs)，则lacZ基因的插入会不受时相的控制而得到正确的翻译[21]。
此外，由于阴性选择基因(多为tk基因)可能在转染及整合过程中失活，导致打靶载体随机整合的ES克隆得以生长，因而PNS载体依然得到较多随机整合的ES克隆。为了提高中靶细胞筛选的效率，常采用启动子缺失的打靶载体[22]。载体中阳性选择标记基因neo是不带启动子的，只有发生正确的同源重组，neo基因被精确地插入靶基因启动子后，抗性基因才会表达，并使ES克隆在选择性药物培养基中存活下来。若在neo基因5’端连接上IREs位点，则可以在任意外显子中插入而起相同的作用。
（二） 大规模随机基因剔除—基因捕获(gene trapping)
用常规方法进行基因打靶，必须针对靶位点在染色体组文库中筛选相关的染色体组克隆，需耗费大量的时间和人力。利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用，更有效和更迅速地进行小鼠染色体组的功能分析[23]。典型的基因捕获载体包括一个无启动子的报道基因，通常是neo基因。neo基因插入到ES细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的ES克隆可以很容易地在含G418的选择培养基中筛选出来。从理论上讲，在选择培养基中存活的克隆应该100％地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析来获得。
用基因捕获法在单次实验中可以获得数以百计的带有单基因剔除的ES克隆。但此方法的缺点是只能剔除在ES细胞中表达的基因。随着应用哺乳动物体细胞克隆新个体的成功实现[24，25]。在体细胞中应用基因捕获剔除更多在发育晚期才表达的基因，其后通过核移植技术获得带有突变基因的动物个体、这不失为一种可以弥补以上缺陷的办法。此外用基因捕获法进行基因剔除的另一个缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰。
（三）精细突变的引入
人类疾病中许多是由于基因功能丧失引起的，也有许多是由于基因过表达或功能获得（gain of function）引起的。对后者就无法用基因剔除的方法获得相应的疾病模型。为此，研究者发明了各种可以将诸如插入终止密码子或替换某个氨基酸之类的精细突变引入小鼠基因组中的方法。早期的研究者采用的方法主要有两种，一是将不含选择标记基因的打靶载体直接经显微注射法引入ES细胞，然后用PCR分析鉴定同源重组克隆[26]；另一种是用带有精细突变但无选择标记基因的打靶载体与仅含标记基因的载体经电穿孔共转染ES细胞[27]。这两种方法在技术上有很大局限性，现在基本上已不再使用。目前较为常用的方法主要有“Hit and Run”、“Tag and Exchange”以及基于重组酶系统的方法[28]。
（1）打了就走策略 (Hit and Run 法)
Hit and Run法，也称进退策略。这一方法包括两次同源重组：第一步（Hit）用插入型载体进行同源重组，这样会在靶位点插入带有突变的基因组序列以及载体骨架，载体骨架上带有两个筛选标记（如正筛选标记基因neo和负筛选标记基因tk）。第二步（Run）利用tk抗性筛选，富集为数不多的发生了染色体内重组的克隆。染色体内重组去除了含有负筛选标记基因的载体序列，由于负筛选标记基因的消失，细胞就恢复了对负筛选药物的抗性，因此，回复突变体可以在负选择培养基中存活下来。为了便于应用Southern方法对中靶克隆进行筛选，可对靶基因突变位点的相邻核苷酸进行改造，产生一个新的限制性内切酶位点而不影响相邻氨基酸的组成。有时可以通过改变碱基组成使突变基因序列和野生型基因序列间的差异达到最大，以便于用不同的PCR引物检出突变基因和野生型基因。Hasty等[28]用此方法在小鼠ES细胞同源异型基因簇Hox-2.6基因3’ 端引入了一个终止密码子，得到了减少43个氨基酸的突变蛋白。
Hit and Run法的不足之处是：第一，此过程中第二步染色体内的同源重组无法精确地控制，可能会导致失去携带突变的同源序列，而留在基因组中的仍是未修饰的内源片段。第二，整个过程需要采用两种培养基分别进行先后两次筛选。第三，无法同时引进多个位点突变。另一类采用置换型载体进行基因打靶、将突变经过两次同源重组引入靶基因的策略部分地弥补了这些缺陷。
（2）双置换法 (Double Replacement)
最早提出这一设想的研究者称其为“In-Out”法[29]。第一步用含有Hprt基因的打靶载体转染Hprt– ES细胞，由于Hprt基因双侧是靶基因的同源序列。通过在HAT培养基中筛选并用PCR进行基因组分析，筛选发生同源重组、Hprt 基因整合到基因组中的阳性克隆。第二步，用只携带突变同源序列的打靶载体转染第一步获得的Hprt+ES细胞。同源重组发生后，突变序列整合入基因组，Hprt 被置换出来。Hprt–细胞可在6-GT培养基上筛选并用PCR进行分析。这种方法的优点在于，第一步获得的Hprt+ES细胞，除了可用于产生普通的基因剔除小鼠外，更可作为将不同突变引入靶基因的基础。1995年，Moore[30]等将这种方法稍加改进，称其为“双置换法”（double replacement）。他们用这种方法将5种突变分别引入Prion蛋白基因，探讨研究人类Prion蛋白相关疾病及其基因治疗的可能性。
（3）“标记和置换”法 (Tag and Exchange)
“标记和置换”的策略与双置换法有许多共同之处。它是用两个不同的置换型载体进行两次连续的基因打靶完成的。通过第一步的同源重组插入正负筛选标记基因（如neo和tk）对靶基因进行“标记”。第二步打靶用在同源序列上带有精细突变的载体来转染第一步得到的ES克隆，带有精细突变的同源序列将置换下被“标记”的靶基因。Askew等[31]用标记和置换法成功地将ES细胞内源的Na+-K+-ATP酶基因改变了两个氨基酸，使其既能维持转膜运输的离子泵功能，又能抵抗强心类糖苷的抑制作用。另有一种类似于“选择与标记”的双置换法，其唯一不同之处在于：第一步所用打靶载体不是单纯的将neo和HSV-tk基因插入靶基因同源序列中，而是在标记基因插入的同时缺失了一段同源序列。Wu等[32]用这种方法将点突变导入内源的胶原蛋白基因Col1a-1,使得能在体内测试这一突变体能否抵抗胶原酶的酶解作用。
（4） 利用Cre-LoxP系统引入点突变
近年来，导入精细突变最常用的方法应首推以Cre-LoxP为基础的重组系统[5，33]。Cre-LoxP位点特异重组酶是由酵母或细菌所编码、可识别特异靶位点并在其上催化断裂和重接、从而产生精确的DNA重组的一类酶。根据序列相似性，重组酶可分为Int家族（integrase family）和resolvase-invertase family。Cre是来源于P1噬菌体cre基因所编码的一个38ku蛋白，属于Int家族，它可识别P1基因组上由34bp核苷酸序列构成的称为LoxP的特异靶位点，并根据Loxp的方向性，可在各种底物（超螺旋环状型，松弛型和线型DNA分子）上介导三种不同的重组事件：①相位点之间序列的缺失；②插入序列；③两个反向位点之间序列颠倒。需指出的是，Cre重组酶所催化的是一个可逆的重组事件，重组的程度与重组酶的表达水平相关。此外在位点特异重组反应的任何阶段上，不需要任何辅助因子参与；该特点使Cre/LoxP位点特异重组酶系统成为可在各类种属上进行意向DNA操作的有用工具。[34，35]
应用Cre-LoxP系统将精细突变导入基因组的策略为：在置换型的打靶载体中，正负筛选标记基因两侧各放置一个LoxP序列，并被置于靶基因的内含子中。携带精细突变的外显子位于载体一侧的同源臂上。经过同源重组和突变的鉴定后（如利用新产生的酶切位点来鉴定），通过转染将Cre重组酶表达质粒导入中靶ES细胞。
近年来，研究者利用Cre-LoxP系统研制了多种携带精细突变的小鼠。糖皮质激素受体（GR）基因剔除导致小鼠在出生时死亡[36]。为了进一步深入研究GR介导糖皮质激素在活体中的功能及其机制，Reichardt等[37]利用Cre-LoxP系统得到了在GR基因的某一个二聚体功能域（dimerization domain）带有点突变的小鼠（GRdim）。GRdim突变小鼠成为研究ER调节生理和病理过程的功能及其机制的良好动物模型。
Huppert等[38]将小鼠Notch1基因的第1744个氨基酸由缬氨酸（GTG）突变为甘氨酸（GGG），该突变位点是蛋白水解酶的消化位点。携带该突变的小鼠与Notch1基因剔除小鼠的表型十分相似，在胚胎期12.5d前死亡。对该小鼠的表型分析结果表明，有效的膜内信号转导过程对于胚胎发育是必需的。
Single等[39]利用

[ Last edited by gene121 on 2007-10-9 at 10:54 ] 返回小木虫查看更多