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大质粒转化中有什么提高转化率的方法吗?急!!!

作者 hugang2004_2000
来源: 小木虫 450 9 举报帖子
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请教大家,比较大的酶连产物(12kb)在转化到大肠杆菌中的时候有什么提高转化效率的方法吗?我们做的感受态大肠杆菌就是用分子克隆中的CaCl2方法,转化的大体步骤如下:
1. 酶连产物加入到200ul感受态细胞悬液中,flicking slightly
2. 冰上30分钟
3. 42度热激90秒
4. 冰上5分钟immediately
5. 超净台中加入1ml LB
6. 37度静置1h
7. 5000rpm, RT, 5min
8. 倾出大部分上清液,剩余大约200ul
9. plating
10. 37度倒置培养12-16小时
11. 挑取克隆
但是转化后总是没有克隆,用这种方法做的时候,其他比较小的酶连产物(<9kb)的转化结果都挺成功的,因此就觉得症结所在就是酶连产物太大,还没有找到合适的解决方法,拖了挺长时间了,请大家多多帮忙!!谢谢!! 返回小木虫查看更多

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  • 精华评论
  • guohuayin

    做电转化也不是很难的,不要过分担心了,我给你个我用的很好的方法:
    1. 取10ul菌液加入含有10ml SOB液体培养基的50ml三角瓶中,37℃,220rpm,过夜培养。
    2. 第二天,以1:100的比例将培养的菌液加入100mlSOB液体培养基中,37度,220rpm,振摇2-3小时,每半小时测一次OD600,当OD600值达到0.5-0.6时,停止培养。
    3. 将菌液在冰上预冷30分钟,随后将菌液转移入预冷的离心管中,4℃,2500rpm离心10分钟。
    4. 弃上清,向离心管中加入100ml灭菌的双蒸水(4℃保存),重新悬浮菌体,然后4℃,4000rpm离心10分钟。
    5. 弃上清,加入50ml灭菌的双蒸水(4℃保存),重新悬浮菌体,然后4℃,4000rpm,离心10min。
    6. 弃上清,往离心管中加入50ml灭菌的10%甘油 (4℃保存),重悬菌体,4000rpm, 离心10min。
    7. 再加入50ml灭菌的10%甘油(4℃保存),重新悬浮菌体,然后4℃, 4000rpm, 离心10min。
    8. 弃上清,每个离心管中加入1ml10%的甘油(4℃保存),使沉淀悬浮后,将菌液以80ul/管分装于1.5ml的离心管中,-80 ℃冰箱中保存,

  • hugang2004_2000

    引用回帖:
    Originally posted by guohuayin at 2007-10-5 08:13 AM:
    做电转化也不是很难的,不要过分担心了,我给你个我用的很好的方法:
    1. 取10ul菌液加入含有10ml SOB液体培养基的50ml三角瓶中,37℃,220rpm,过夜培养。
    2. 第二天,以1:100的比例将培养的菌液加入100mlSOB液 ...

    谢谢guohuayin老乡!嗬嗬
    俺是青岛的,恁家是哪里的?哈哈! 学校在哪里呢?
    有空多指点!对了,转化的方法呢?不能只让我做cpcell 吧?嗬嗬

    [ Last edited by hugang2004_2000 on 2007-10-5 at 08:39 ]

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