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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 蛋白质纯化问题
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湖南戴鹏辉

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白质纯化问题 已有9人参与

各位大神，我做了蛋白质的原核表达实验，能清晰的看到目的蛋白质表达了（载体是PET-28a,宿主是BL21（DE3）），但是我后面做蛋白质纯化实验的时候不能纯化到蛋白。我的超声波破碎细胞的条件是：400W，5S破碎，5S停止，30分钟，后面分别SDS-PAGE检测上清液和沉淀，发现上清液没有纯化到我的蛋白，蛋白都在沉淀里面了，条带特别明显，不知道怎么回事？是不是细胞没有破碎完全呢？怎么样才能解决这个问题？求大神指点，相互交流。谢谢！
蛋白质纯化问题
IMG_20160108_170606.jpg
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好好生活，好好工作
1楼 2016-01-18 09:33:41
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鱼大喵

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.我感觉你超声5s停止的时间有点短，超声热量很大的
2.离心后看沉淀是不是发白，是的话就可能是包涵体了
3.将你的蛋白序列做一下跨膜预测，看是不是有疏水域
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8楼2016-01-18 21:09:16
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a86052

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这有什么奇怪，超声破碎后菌夜什么情况，是比较清的那种还是发白？如果发白可能是包涵体或者蛋白变性了
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2楼2016-01-18 10:04:38
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XMC-7

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
莫慌莫慌，看你表述的情况，并不奇怪啊。破菌后，目的蛋白不溶于破菌Buffer，下面离心后增溶纯化就是了。额，是没人带的可怜新手么？
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能帮的帮，难事求助的心情咱也经历过
3楼2016-01-18 10:17:14
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
超声破碎，上清里面没有目的蛋白，全沉淀里面，估计是包涵体了。那就将沉淀用8M的尿溶解，然后在离心，溶解后的上清在跑电泳，在纯化。纯化完了，在复性。或者可尝试低温诱导，避免包涵体的形成，可以25度诱导试试，祝顺利。
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4楼2016-01-18 10:31:39
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