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蛋白质纯化问题 已有3人参与
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现在目前遇到的问题： 1，超滤过程中蛋白质的去除率能够达到多少，有篇文献上，题名“Simplified purification of equine chorionic gonadotropin (eCG) – an example of the use of magnetic microsorbents for the isolation of glycoproteins from serum”表2中，达到了98% 2.不知道这种酸性蛋白能不能用阳离子交换树脂进行纯化，可是真的有发现，文献比我的蛋白等电点p低的ecg用了阳离子交换树脂，“题名”Extraction of Equine Chorionic Gonadotrophin from Pregnant Mare Plasma by Direct Adsorption on Chromatographic Media“。 3，离子交换介质的上样缓冲液，假如是乙酸钠缓冲液，那洗脱的时候能否使磷酸盐缓冲液。 4，由于活性的测定过程比较麻烦，费钱费力，所以不能更多的尝试方法。 |
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2楼2015-06-16 20:59:23
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3楼2015-06-16 21:29:17
冼亮淀粉酶
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4楼2015-06-16 21:53:07
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6楼2015-06-16 22:19:58
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【答案】应助回帖
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我说一次选择离子交换柱的一般原则。 在考虑离子交换剂（离子交换功能基团）的强弱时，如果目的蛋白质很稳定，应首先选用强交换介质，强交换介质的动力载量不会随pH值的不同而改变，离子交换过程遵循最基本的吸附原理。所谓的蛋白质的稳定性，一般可从其耐受的酸碱性、离子强度、温度范围这几个角度考虑，考虑蛋白质的稳定的极限是防止蛋白质变性，而不是发生蛋白质共价修饰，甚至降解。用各种层析柱分离提纯蛋白质时，一般不是常温，就是低温，所以通常不必考虑温度对于需要层析的目的蛋白质的影响，但是蛋白质的酸碱性和离子强度的耐受性则必须要考虑。这点是很多蛋白质分离提纯的新手所容易忽略的。 使用强离子交换介质允许较大的吸附pH及离子交换强度选择范围，目的分子吸附后只需要提高缓冲的盐浓度即可洗脱，同时可有目的分子的浓缩效应。而若离子交换介质pH适用范围较小，在pH小于6时，弱阳离子交换介质失去电荷，而在pH大于9时，弱阴离子交换介质失去电荷。所以，一般情况下，在分离等电点pH 6-9的目的蛋白质，尤其是当目的蛋白质分子不稳定时，需要较温和的色谱条件才会选用弱交换介质。对于未知的蛋白质进行离子交换层析柱分离提纯时，也建议首先使用弱交换介质。 楼主的蛋白质的等电点在2.2，如果选择阳离子交换层析，你的缓冲溶液的pH必须要低于2.2，保证你的目的蛋白质能够带上正电荷，进而能够挂在阳离子交换层析柱上。真的有没有缓冲溶液到了这样的pH还有缓冲容量？我是没有听说过，可能以后会有吧。 当然，利用阴离子交换层析柱就很方便了，只要你的缓冲溶液的pH高于于2.2，保证你的目的蛋白质能够带上负电荷，进而能够挂在阴离子交换层析柱上就行。这样的缓冲液很容找到。 超滤一般只能够用于去除无机和有机小分子，这些小分子至少与一般的常见蛋白质的相对分子量相差2个数量以上，这是超滤离心管的滤膜的孔径决定的，由于一个超离心管就只有一层膜一种滤过孔径，所以凡是不能穿过的蛋白质都留下了，所以超滤离心管根本不可能用于分离纯化不同的蛋白质！跟不要说什么分离效率了。超滤离心管是除去小分子物质的. |
9楼2015-06-18 14:00:10
calorimetry
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