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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 蛋白质纯化问题
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bao可雅

新虫 (小有名气)

[求助] 蛋白质纯化问题 已有3人参与

现在目前遇到的问题：
1，超滤过程中蛋白质的去除率能够达到多少，有篇文献上，题名“Simplified purification of equine chorionic gonadotropin (eCG) – an example of the use
of magnetic microsorbents for the isolation of glycoproteins from serum”表2中，达到了98%
2.不知道这种酸性蛋白能不能用阳离子交换树脂进行纯化，可是真的有发现，文献比我的蛋白等电点p低的ecg用了阳离子交换树脂，“题名”Extraction of Equine Chorionic Gonadotrophin from Pregnant Mare Plasma by Direct Adsorption on Chromatographic Media“。
3，离子交换介质的上样缓冲液，假如是乙酸钠缓冲液，那洗脱的时候能否使磷酸盐缓冲液。
4，由于活性的测定过程比较麻烦，费钱费力，所以不能更多的尝试方法。
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1楼 2015-06-16 20:54:41
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bao可雅

新虫 (小有名气)
自己顶一下，快快来人啊
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2楼2015-06-16 20:59:23
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bao可雅

新虫 (小有名气)
3楼2015-06-16 21:29:17
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
bao可雅: 金币+5 2015-07-06 09:49:25
一步法就能够纯化蛋白质是很难的，除非亲和层析。对于你的蛋白质到底能达到什么效果，还得自己来做才知道。我遇到最极端的情况就是，文献上达到一步纯化，但自己完全做不出来。

等电点在酸性的蛋白质如果用阴离子交换柱层析应该是都能吸附上的，至于是不是用阳离子交换，只要是要看这个蛋白质的pH稳定范围。

洗脱的时候我的习惯用法是用同样的缓冲液。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2015-06-16 21:53:07
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bao可雅

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2015-06-16 21:53:07
一步法就能够纯化蛋白质是很难的，除非亲和层析。对于你的蛋白质到底能达到什么效果，还得自己来做才知道。我遇到最极端的情况就是，文献上达到一步纯化，但自己完全做不出来。

等电点在酸性的蛋白质如果用阴离子 ...

请问大神有用过超滤吗？为什么他的超滤效果会那么好，蛋白去除率那么高
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5楼2015-06-16 22:17:26
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bao可雅

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2015-06-16 21:53:07
一步法就能够纯化蛋白质是很难的，除非亲和层析。对于你的蛋白质到底能达到什么效果，还得自己来做才知道。我遇到最极端的情况就是，文献上达到一步纯化，但自己完全做不出来。

等电点在酸性的蛋白质如果用阴离子 ...

那也就说，如果酸性蛋白稳定，在合理的ph范围内也是可以用阳离子交换树脂的了，但是我的等电点只有2.2
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6楼2015-06-16 22:19:58
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
引用回帖:
6楼: Originally posted by bao可雅 at 2015-06-16 22:19:58
那也就说，如果酸性蛋白稳定，在合理的ph范围内也是可以用阳离子交换树脂的了，但是我的等电点只有2.2...

那就只能用阴离子，可能有阳离子交换层析柱能在1.0下用，但我还没有发现。
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7楼2015-06-16 23:39:33
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
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5楼: Originally posted by bao可雅 at 2015-06-16 22:17:26
请问大神有用过超滤吗？为什么他的超滤效果会那么好，蛋白去除率那么高...

我们也用过超滤，但是不是做蛋白纯化，主要是分离和脱盐，而且也绝对达不到98%。。。
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
8楼2015-06-18 10:33:18
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
bao可雅: 金币+20 2015-07-06 09:49:36
我说一次选择离子交换柱的一般原则。
在考虑离子交换剂（离子交换功能基团）的强弱时，如果目的蛋白质很稳定，应首先选用强交换介质，强交换介质的动力载量不会随pH值的不同而改变，离子交换过程遵循最基本的吸附原理。所谓的蛋白质的稳定性，一般可从其耐受的酸碱性、离子强度、温度范围这几个角度考虑，考虑蛋白质的稳定的极限是防止蛋白质变性，而不是发生蛋白质共价修饰，甚至降解。用各种层析柱分离提纯蛋白质时，一般不是常温，就是低温，所以通常不必考虑温度对于需要层析的目的蛋白质的影响，但是蛋白质的酸碱性和离子强度的耐受性则必须要考虑。这点是很多蛋白质分离提纯的新手所容易忽略的。
使用强离子交换介质允许较大的吸附pH及离子交换强度选择范围，目的分子吸附后只需要提高缓冲的盐浓度即可洗脱，同时可有目的分子的浓缩效应。而若离子交换介质pH适用范围较小，在pH小于6时，弱阳离子交换介质失去电荷，而在pH大于9时，弱阴离子交换介质失去电荷。所以，一般情况下，在分离等电点pH 6-9的目的蛋白质，尤其是当目的蛋白质分子不稳定时，需要较温和的色谱条件才会选用弱交换介质。对于未知的蛋白质进行离子交换层析柱分离提纯时，也建议首先使用弱交换介质。
楼主的蛋白质的等电点在2.2，如果选择阳离子交换层析，你的缓冲溶液的pH必须要低于2.2，保证你的目的蛋白质能够带上正电荷，进而能够挂在阳离子交换层析柱上。真的有没有缓冲溶液到了这样的pH还有缓冲容量？我是没有听说过，可能以后会有吧。
当然，利用阴离子交换层析柱就很方便了，只要你的缓冲溶液的pH高于于2.2，保证你的目的蛋白质能够带上负电荷，进而能够挂在阴离子交换层析柱上就行。这样的缓冲液很容找到。
超滤一般只能够用于去除无机和有机小分子，这些小分子至少与一般的常见蛋白质的相对分子量相差2个数量以上，这是超滤离心管的滤膜的孔径决定的，由于一个超离心管就只有一层膜一种滤过孔径，所以凡是不能穿过的蛋白质都留下了，所以超滤离心管根本不可能用于分离纯化不同的蛋白质！跟不要说什么分离效率了。超滤离心管是除去小分子物质的.
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9楼2015-06-18 14:00:10
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

如果有人能够在任何一步蛋白质的分离效率（是分离不同种类的蛋白质的效率）能够达到98%，此人完全有资格竞争诺贝尔科学奖。
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10楼2015-06-18 14:05:21
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