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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩增产物，出现拖尾现象，
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风铃永不孤单

银虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增产物，出现拖尾现象， 已有2人参与

前天的时候，我用冻融后的DNA模板，抽取1ul稀释20倍，进行PCR扩增后，进行琼脂糖电泳，发现有几个样品扩增的比较弱，重新扩增后，还是较弱。分析原因可能是原始的DNA样品在冻融后可能会出现DNA分布不均匀现象。
今天，对原始DNA样板进行重新稀释20倍（原始DNA样板冻融后，充分混合，抽取1ul稀释20倍），进行PCR扩增后，进行琼脂糖电泳。果然都扩出来了，而且特别的亮。但是问题又来了，拖尾比较严重，敢问哪位知道造成这种情况的原因是什么？？？附上图

PCR扩增产物，出现拖尾现象，
1.jpg
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1楼 2015-11-20 21:15:10
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xushiqi001

新虫 (小有名气)
减少酶量，减少循环数，提高退火温度。

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7楼2015-11-20 22:45:59
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普通回帖

风铃永不孤单

银虫 (小有名气)
减小循环次数是不是也可以避免拖尾
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2楼2015-11-20 21:17:36
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liuxinyueer

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1,2,3,4拖尾中明显有非特异性扩增，建议提高退火温度
另外拖尾可能的原因为：1.有杂质。2.上样浓度高
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3楼2015-11-20 21:22:14
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风铃永不孤单

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by liuxinyueer at 2015-11-20 21:22:14
1,2,3,4拖尾中明显有非特异性扩增，建议提高退火温度
另外拖尾可能的原因为：1.有杂质。2.上样浓度高

若出现非特异性扩增，那可以用P的产物进行DGGE吗？跑出来的DGGE，可不可行？
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4楼2015-11-20 21:24:50
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liuxinyueer

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 风铃永不孤单 at 2015-11-20 21:24:50
若出现非特异性扩增，那可以用P的产物进行DGGE吗？跑出来的DGGE，可不可行？...

没做过DGGE，但建议割胶纯化

发自小木虫IOS客户端
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5楼2015-11-20 21:34:06
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liukai123

新虫 (小有名气)
换大点的梳子孔，减少上样量，胶做厚点，再跑就漂亮了。

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6楼2015-11-20 21:59:00
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woolley

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by liukai123 at 2015-11-20 21:59:00
换大点的梳子孔，减少上样量，胶做厚点，再跑就漂亮了。

我也是这么认为的。
通常情况下，上样孔附近都是凝胶最厚的地方。如果胶比较薄或者不均匀的话，很容易出现这样的拖尾。
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8楼2015-11-21 10:35:35
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luckydog52

木虫 (著名写手)
扩增的问题我就不说了。你看你的Marker也拖尾，说明电泳过程有问题。
1.你的胶太薄了，多加点。
2.上样量太多，减去一半试试
3.配胶的和电泳的电泳液换换新的，
4.电压低点

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自信源于一次次成功的积累
9楼2015-11-21 14:01:41
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风铃永不孤单

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by luckydog52 at 2015-11-21 14:01:41
扩增的问题我就不说了。你看你的Marker也拖尾，说明电泳过程有问题。
1.你的胶太薄了，多加点。
2.上样量太多，减去一半试试
3.配胶的和电泳的电泳液换换新的，
4.电压低点
...

恩啊。谢谢哈~~~还有个问题就是跑DGGE时，电压60V跑20h和电压80V跑16个小时有什么区别呢？？？
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10楼2015-11-22 09:33:10
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