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风铃永不孤单

银虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增产物,出现拖尾现象, 已有2人参与

前天的时候,我用冻融后的DNA模板,抽取1ul稀释20倍,进行PCR扩增后,进行琼脂糖电泳,发现有几个样品扩增的比较弱,重新扩增后,还是较弱。分析原因可能是原始的DNA样品在冻融后可能会出现DNA分布不均匀现象。
今天,对原始DNA样板进行重新稀释20倍(原始DNA样板冻融后,充分混合,抽取1ul稀释20倍),进行PCR扩增后,进行琼脂糖电泳。果然都扩出来了,而且特别的亮。但是问题又来了,拖尾比较严重,敢问哪位知道造成这种情况的原因是什么???附上图

PCR扩增产物,出现拖尾现象,
1.jpg
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xushiqi001

新虫 (小有名气)

减少酶量,减少循环数,提高退火温度。

发自小木虫Android客户端
7楼2015-11-20 22:45:59
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普通回帖

风铃永不孤单

银虫 (小有名气)

减小循环次数是不是也可以避免拖尾
2楼2015-11-20 21:17:36
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liuxinyueer

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1,2,3,4拖尾中明显有非特异性扩增,建议提高退火温度
另外拖尾可能的原因为:1.有杂质。2.上样浓度高
欢迎讨论,小木虫未能及时回复,请邮箱: lmzhang1994@gmail.com
3楼2015-11-20 21:22:14
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风铃永不孤单

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by liuxinyueer at 2015-11-20 21:22:14
1,2,3,4拖尾中明显有非特异性扩增,建议提高退火温度
另外拖尾可能的原因为:1.有杂质。2.上样浓度高

若出现非特异性扩增,那可以用P的产物进行DGGE吗?跑出来的DGGE,可不可行?
4楼2015-11-20 21:24:50
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liuxinyueer

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 风铃永不孤单 at 2015-11-20 21:24:50
若出现非特异性扩增,那可以用P的产物进行DGGE吗?跑出来的DGGE,可不可行?...

没做过DGGE,但建议割胶纯化

发自小木虫IOS客户端
欢迎讨论,小木虫未能及时回复,请邮箱: lmzhang1994@gmail.com
5楼2015-11-20 21:34:06
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liukai123

新虫 (小有名气)

换大点的梳子孔,减少上样量,胶做厚点,再跑就漂亮了。

发自小木虫Android客户端
6楼2015-11-20 21:59:00
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woolley

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by liukai123 at 2015-11-20 21:59:00
换大点的梳子孔,减少上样量,胶做厚点,再跑就漂亮了。

我也是这么认为的。
通常情况下,上样孔附近都是凝胶最厚的地方。如果胶比较薄或者不均匀的话,很容易出现这样的拖尾。
8楼2015-11-21 10:35:35
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luckydog52

木虫 (著名写手)

扩增的问题我就不说了。你看你的Marker也拖尾,说明电泳过程有问题。
1.你的胶太薄了,多加点。
2.上样量太多,减去一半试试
3.配胶的和电泳的电泳液换换新的,
4.电压低点

发自小木虫Android客户端
自信源于一次次成功的积累
9楼2015-11-21 14:01:41
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风铃永不孤单

银虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by luckydog52 at 2015-11-21 14:01:41
扩增的问题我就不说了。你看你的Marker也拖尾,说明电泳过程有问题。
1.你的胶太薄了,多加点。
2.上样量太多,减去一半试试
3.配胶的和电泳的电泳液换换新的,
4.电压低点
...

恩啊。谢谢哈~~~还有个问题就是跑DGGE时,电压60V跑20h和电压80V跑16个小时有什么区别呢???
10楼2015-11-22 09:33:10
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