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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 聚丙烯酰胺凝胶效果
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Le悠悠

金虫 (初入文坛)

[求助] 聚丙烯酰胺凝胶效果 已有2人参与

大神们帮帮忙呀，请问做聚丙烯酰胺凝胶之后，条带一直不清楚是什么问题呢，要怎么解决呀？PCR结果做琼脂糖凝胶是有条带的，但聚丙烯的效果一直不好

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笑一笑，没什么大不了
1楼 2015-11-04 09:31:26
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asayang

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的产物条带是多大的？聚丙烯酰胺凝胶浓度多少？电泳缓冲液是否新鲜配置？
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2楼2015-11-05 08:58:44
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Le悠悠

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by asayang at 2015-11-05 08:58:44
你的产物条带是多大的？聚丙烯酰胺凝胶浓度多少？电泳缓冲液是否新鲜配置？

100—200,8%的变性聚丙烯酰胺凝胶，电泳缓冲液每次都是现用现配，不重复使用
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笑一笑，没什么大不了
3楼2015-11-05 09:45:16
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
目的蛋白质条带模糊可能不光是凝胶的问题，还可能存在以下情况：
1.电泳凝胶浓度选择不当。
2.低于10Kd的小分子蛋白质要用Tricine胶。
3.靠近前沿的电泳带分辨率不佳。根据分子量与凝胶孔径的关系，选择适当浓度的凝胶。
4.蛋白质样品水解。注意除去蛋白质样品的内源性的水解酶，不要反复冻融。
5.电泳时间过长或过短。溴酚蓝达到分离胶的底部即应该关闭电泳电源。
6.缓冲溶液、SDS都要新鲜配制。
7.避免加样过多，提高分辨率。小体积样品可给出窄带，加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15uL（即2-10ug蛋白质）。
8.加热变性后的蛋白质样品要放置到室温即电泳，不要久放，因为蛋白质的二硫键在高温下可能是会断开，但是暴露于空气中温度降低会重新形成二硫键，而且可能在过久放置过程中蛋白质可能会再折叠，更不要扔到冰箱里保存。
在蛋白表达与纯化上还有问题可以看看这个：SDS-PAGE常见问题解析
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
4楼2015-11-05 09:51:20
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Le悠悠

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 恶魔的左眼 at 2015-11-05 09:51:20
目的蛋白质条带模糊可能不光是凝胶的问题，还可能存在以下情况：
1.电泳凝胶浓度选择不当。
2.低于10Kd的小分子蛋白质要用Tricine胶。
3.靠近前沿的电泳带分辨率不佳。根据分子量与凝胶孔径的关系，选择适当浓度 ...

非常感谢，那做DNA呢，为什么出现这样的问题呢，我们做的是DNA，SSR标记呀
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笑一笑，没什么大不了
5楼2015-11-05 10:55:06
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Le悠悠 at 2015-11-05 10:55:06
非常感谢，那做DNA呢，为什么出现这样的问题呢，我们做的是DNA，SSR标记呀...

我去，看错了。。。你看看这个吧，DNA这块我很少接触的。。。
　1)DNA 降解。避免核酸酶污染。
　2)DNA 上样量过多。减少凝胶中 DNA 上样量。
　3)电泳缓冲液陈旧: 电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低， pH 值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。
　4)电泳条件不合适。电泳时电压不应超过 20V/cm ，温度＜30 ℃ ,巨大 DNA 链，温度应＜15 ℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。
　5)DNA 样含盐过高。泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。
　6)有蛋白污染。电泳前抽提去除蛋白。
　7) DNA 变性。电泳前勿加热，用 20mM NaCl 缓冲液稀释 DNA 。
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
6楼2015-11-05 11:21:22
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