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DNA凝胶回收方法及常见问题
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琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、鉴定和纯化核酸和蛋白质片断的标准方法。聚丙烯酰胺凝胶电泳片段的回收将在以后的文章中介绍，在这里我先介绍一下琼脂糖凝胶电泳片断回收的常用方法，方便大家学习交流。 从琼脂糖凝胶中回收DNA，是一种简单不过的常规实验操作。但是由于胶回收的质量和数量直接影响后继的一系列实验――比如酶切连接、转化筛选、测序或者PCR扩增、标记乃至显微注射等等，所以这一步的操作也显得非常重要。 胶回收的质量好否直接影响后继实验的成功与否。现今除了手工回收方法外，许多公司都开发了方便的回收试剂盒系列，但是无论借助何种方式，最基本的评定标准均包括: . 回收产物质量：主要指纯度。常规电泳过程中，普通级别的琼脂糖自带的一些性状不明的多糖，会连同DNA一起从凝胶中抽提出来，强烈抑制后继的连接、酶切、或者标记、扩增等实验。对于大片断DNA回收，质量还包括产物的完整性；而对于较小片断回收，质量还包括回收产物的浓度；此外，极微量的纯化介质或者是某些试剂混入回收产物中也会对结果产生致命的影响。 . 回收率：由于上电泳样品量通常都很少，电泳过程本身也会导致样品的分散和损失，因而尽可能多的回收电泳凝胶条带中的目的片断，提高产物得率，对于后继实验来说是非常重要的。回收率的多少通常和回收产物的大小以及量的多少有关，比如DNA片断越大，和固相基质的结合力越强，就越难洗脱，回收率就低；又如，DNA的量越少，相对损失越大，回收率越低。因此，根据情况选择不同的方法是很重要的。 . 其他：操作方面，操作简单，快速，应用方便的方法或产品自然比较受欢迎。如溶胶的缓冲液中添加指示剂，可以指示溶胶的溶液pH值就是很方便的设计；离心过柱就比离心沉淀要简单方便。还有要注意载量问题，因为对于纯化柱或者一定量的纯化介质都有一定的吸附限度，过量的产物吸附不了即被损失掉。 以下是我总结的常见问题，希望对大家有所帮助。 Q1：利用凝胶回收试剂盒DNA回收效率较低或者未回收到目的片段？ A1: 可能有以下几个原因： 1. 胶块未完全溶解，溶解凝胶时应置于55℃水浴，可适当延长水浴时间，并增加上下颠倒次数,确定胶块完全溶解后再进行下一步骤; 2. 胶块体积太大,应使用枪头捣碎，还不能充分溶解，则应先将其切为小块，分多次回收或选用大量型回收试剂盒； 3.紫外灯下切胶时间过长，导致DNA部分降解，应尽量把切胶时间控制在30s以内； 4. 电泳缓冲液pH太高，硅基质膜在高盐低pH值（pH≤7.5）时可结合DNA，在低盐及高pH值（pH≥8）条件下洗脱。如果电泳缓冲液pH值太高，会导致DNA无法结合或降低结合率。可在溶胶后加入 10μl KAc（pH5.0），将pH值调至7.5以下;最好使用新鲜配制的电泳缓冲液，效果更好。 5. 漂洗液中未加入无水乙醇。第一次使用前应在漂洗液中加入无水乙醇。漂洗液每次用后应拧紧瓶盖，以免乙醇挥发，降低回收率。 6. 洗脱缓冲液不合适.DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB (10 mM Tris•Cl, pH8.5)或水。洗脱效率取决于pH值。最大洗脱效率在pH 7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内。 7. 洗脱缓冲液未加在离心柱中间尤其使用较少量洗脱缓冲液时，应加在离心柱正中间，并放置1-2min，再离心。 8. 洗脱前，预先65℃预热洗脱液、延长室温静置时间、增加洗脱次数可以有效提高回收率30%以上。 9. 加入异丙醇后产生雾状和凝胶状沉淀。这种现象可能是盐沉淀，颠倒混合样品沉淀就会消失。或者是胶块没有完全溶解，此时可将混合物加入离心柱，离心，在离心柱中再加入0.5 ml 溶胶液室温放置1min，离心即可除去剩余琼脂糖凝胶。 Q2：回收后的片段无法用于后续实验，如连接等。 A2：可能有以下几个原因： 1. 洗脱产物含有残留的乙醇。洗脱时硅胶膜或硅胶树脂上有漂洗缓冲液残留，会使洗脱产物中含有乙醇，影响下游操作。请确保彻底去除漂洗缓冲液，在洗脱前可通过再次离心或置于50℃烤箱中5-10分钟。 2. 洗出液中污染有琼脂糖。凝胶未全部溶解。 3. 洗脱产物含有ssDNA，表现为在琼脂糖电泳上呈小弥散带。将洗脱产物95℃加热 2 min,慢慢冷却到室温，使单链DNA重新退火复性即可。 Q3：可否使用更小洗脱体积(小于说明书提供的最小洗脱体积)进行洗脱以提高浓度？ A3：不可以。因为说明书提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积，若减少体积则不能将DNA完全洗脱下来。 Q4：电泳检测只有一条目的带，可否选用凝胶回收试剂盒？ A4：可以。如果后续实验对片段纯度要求较高，建议即使只有一条带，也可以切胶纯化，其回收得到片段的纯度可能要比直接回收高一些。 Q5：如何看待提取得率？ A5：影响回收率的因素很多，如DNA片段大小、点样量、凝胶种类、电泳缓冲液的缓冲能力、切胶操作、紫外灯照射强度和时间、溶胶是否彻底等等，所以不能单凭1-2次的实验来判断其质量好坏，最好是多做几次实验或用几种不同品牌的产品做平行对照实验，结果相对真实。 Q6：加入溶胶液温浴后，液体仍很粘稠或后续步骤有堵柱子现象？ A6：1）胶块溶解不充分，可再补加一些溶胶液或延长水浴时间并增加上下颠倒次数帮助溶胶； 2）胶块体积过大，应尽量切除多余部分，并将其切为小碎块，分几次回收； 3）水浴温度是否达到规定温度65℃，用温度计检测。 Q7：为什么溶胶不彻底会影响回收结果的纯度？ A7：在电泳过程中，DNA会与大分子的多糖紧密地结合在一起，凝胶的种类和质量不同，DNA与之结合力也不同，只有凝胶充分溶解，DNA才能充分释放，否则，凝胶将与DNA一起沉淀下来，洗脱后将影响回收结果的纯度。 |
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2楼2012-06-01 07:08:32
