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xiaochen9002

新虫 (小有名气)

[求助] 蛋白纯化不出来…… 已有6人参与

手上有一个蛋白,大肠表达后镍柱纯化,得到了目的条带,但是还有三条杂带,估计是截短表达的蛋白。目前已经用了好多方法去除杂带,50KDa的超滤管,阴阳离子交换柱以及分子筛,都没分开,不知道各位有什么好的方法没?实在快疯了,  电泳图附上,红色的是我要的条带,静候各位大牛的解答!

蛋白纯化不出来……
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总有二狗咬朕

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
通常使用超滤来纯化蛋白是,其应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3,比如目的蛋白分子量为61kDa,就可以选择20kDa截留分子量的超滤管,所以用55kDa不行;阴阳离子交换柱没分开,说明纯化的重组蛋白与杂蛋白PI接近。但是分子筛应该是可以分得开的,可能楼主的柱效不高,用标准试剂走着看一下,是否能达到应用的要求。还有看看楼主的填料,可能选择的不好,范围太宽了。
我好累,承受这个年纪不该有的帅!
5楼2015-10-28 16:59:39
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
xiaochen9002: 金币+5 2015-11-07 18:06:18
建议好好优化下你的层析过程,离子交换的用DEAE或CM,先离子交换后镍柱,好好优化下层析过程,比如离子交换时,盐拉梯度,慢一些,镍柱拉梯度时,咪唑梯度慢些上升比如0-500mm,原本50个柱体积,你可以增加到200等,缓冲液在优化优化比如用Tris-Hcl试试,缓冲液中加200mm氯化钠,ph也试试,比如6.0.,7.0,8.0等。多试验。祝顺利。
15楼2015-10-29 13:32:36
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普通回帖

a86052

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
分子量看起来差了不少,分子筛一点效果都没有?超滤管一般达不到那么好的纯化效果的。实在不行重新构建吧~
2楼2015-10-28 16:26:44
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by a86052 at 2015-10-28 16:26:44
分子量看起来差了不少,分子筛一点效果都没有?超滤管一般达不到那么好的纯化效果的。实在不行重新构建吧~

分子筛只用过一次,从电泳图上看不出显著地纯化效果。是不是优化下条件就可以了?
3楼2015-10-28 16:42:33
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a86052

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by xiaochen9002 at 2015-10-28 16:42:33
分子筛只用过一次,从电泳图上看不出显著地纯化效果。是不是优化下条件就可以了?...

不一定的,因为你既然从电泳图上看不出纯化效果,也许过分子筛并不能达到要求。如果像你说的,这些是截短表达,那么构建个C端标签的也许会更好。你可以先检测下是不是截短的蛋白
4楼2015-10-28 16:56:46
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 总有二狗咬朕 at 2015-10-28 16:59:39
通常使用超滤来纯化蛋白是,其应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3,比如目的蛋白分子量为61kDa,就可以选择20kDa截留分子量的超滤管,所以用55kDa不行;阴阳离子交换柱没分开,说明纯化的重组蛋白与杂蛋白PI接 ...

关于超滤管的问题,我已经问公司了,他们说50KDa的超滤管是保证50KDa以上的蛋白不掉下来,其他的不保证,看来是行不通了。分子筛用的是superdex-75,1m左右。具体的柱效没有评估,不知道是不是柱效的问题。
6楼2015-10-28 17:32:12
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by a86052 at 2015-10-28 16:56:46
不一定的,因为你既然从电泳图上看不出纯化效果,也许过分子筛并不能达到要求。如果像你说的,这些是截短表达,那么构建个C端标签的也许会更好。你可以先检测下是不是截短的蛋白...

恩,我先找找纯化条件,实在不行,只能重新构建啦
7楼2015-10-28 17:39:32
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高傲的范儿

金虫 (小有名气)


你纯化用的缓冲盐是什么?有没有加吐温20和DTT?

发自小木虫Android客户端
8楼2015-10-29 08:12:42
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 高傲的范儿 at 2015-10-29 08:12:42
你纯化用的缓冲盐是什么?有没有加吐温20和DTT?

20mM的PBS与咪唑,没有加吐温20与DTT。
9楼2015-10-29 08:46:27
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总有二狗咬朕

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by xiaochen9002 at 2015-10-28 17:32:12
关于超滤管的问题,我已经问公司了,他们说50KDa的超滤管是保证50KDa以上的蛋白不掉下来,其他的不保证,看来是行不通了。分子筛用的是superdex-75,1m左右。具体的柱效没有评估,不知道是不是柱效的问题。...

Superdex 75分子筛纯化两种蛋白的分子量相差至少2-3倍,所以楼主的蛋白应该无法用Superdex 75进行分离纯化。
我好累,承受这个年纪不该有的帅!
10楼2015-10-29 09:08:43
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