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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 蛋白纯化不出来……
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sxjcas

禁虫 (知名作家)
本帖内容被屏蔽
11楼2015-10-29 09:14:46
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 总有二狗咬朕 at 2015-10-29 09:08:43
Superdex 75分子筛纯化两种蛋白的分子量相差至少2-3倍，所以楼主的蛋白应该无法用Superdex 75进行分离纯化。...

疯了，不知道咋办了
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12楼2015-10-29 12:19:38
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 总有二狗咬朕 at 2015-10-29 09:08:43
Superdex 75分子筛纯化两种蛋白的分子量相差至少2-3倍，所以楼主的蛋白应该无法用Superdex 75进行分离纯化。...

啊，那应该用什么的填料啊？
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13楼2015-10-29 12:40:42
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by sxjcas at 2015-10-29 09:14:46
试试离子交换了呗。

阴阳离子交换柱都用过了，虽然分出了两个峰，但是收集跑电泳后，仍然没有效果，疯了啊……
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14楼2015-10-29 12:43:48
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xiaochen9002: 金币+5 2015-11-07 18:06:18
建议好好优化下你的层析过程，离子交换的用DEAE或CM，先离子交换后镍柱，好好优化下层析过程，比如离子交换时，盐拉梯度，慢一些，镍柱拉梯度时，咪唑梯度慢些上升比如0-500mm,原本50个柱体积，你可以增加到200等，缓冲液在优化优化比如用Tris-Hcl试试，缓冲液中加200mm氯化钠，ph也试试，比如6.0.，7.0,8.0等。多试验。祝顺利。
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15楼2015-10-29 13:32:36
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高傲的范儿

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 总有二狗咬朕 at 2015-10-29 09:08:43
Superdex 75分子筛纯化两种蛋白的分子量相差至少2-3倍，所以楼主的蛋白应该无法用Superdex 75进行分离纯化。...

那应该用什么规格的分子筛呢？

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16楼2015-10-29 13:41:39
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高傲的范儿

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by a86052 at 2015-10-28 16:56:46
不一定的，因为你既然从电泳图上看不出纯化效果，也许过分子筛并不能达到要求。如果像你说的，这些是截短表达，那么构建个C端标签的也许会更好。你可以先检测下是不是截短的蛋白...

怎么检测是不是截短蛋白？

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17楼2015-10-29 13:43:18
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高傲的范儿

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by xiaochen9002 at 2015-10-29 08:46:27
20mM的PBS与咪唑，没有加吐温20与DTT。...

我室友最近在缓冲液里面加入了DTT和吐温20，去掉了很多带。但不知道是否影响你的蛋白活性，可以试试。

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18楼2015-10-29 13:45:34
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a86052

金虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 高傲的范儿 at 2015-10-29 13:43:18
怎么检测是不是截短蛋白？
...

做个western应该就可以。如果真是截短表达，不妨将TAG构建到蛋白的另一端试下
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19楼2015-10-29 14:01:02
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 高傲的范儿 at 2015-10-29 13:43:18
怎么检测是不是截短蛋白？
...

菌体诱导后，其他的小分子量杂带也会大量出现。我推测是截短表达的。具体鉴定估计得用western，加his-tag的抗体。
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20楼2015-10-29 14:44:30
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