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sxjcas

禁虫 (知名作家)

本帖内容被屏蔽

11楼2015-10-29 09:14:46
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 总有二狗咬朕 at 2015-10-29 09:08:43
Superdex 75分子筛纯化两种蛋白的分子量相差至少2-3倍,所以楼主的蛋白应该无法用Superdex 75进行分离纯化。...

疯了,不知道咋办了
12楼2015-10-29 12:19:38
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 总有二狗咬朕 at 2015-10-29 09:08:43
Superdex 75分子筛纯化两种蛋白的分子量相差至少2-3倍,所以楼主的蛋白应该无法用Superdex 75进行分离纯化。...

啊,那应该用什么的填料啊?
13楼2015-10-29 12:40:42
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)

引用回帖:
11楼: Originally posted by sxjcas at 2015-10-29 09:14:46
试试离子交换了呗。

阴阳离子交换柱都用过了,虽然分出了两个峰,但是收集跑电泳后,仍然没有效果,疯了啊……
14楼2015-10-29 12:43:48
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
xiaochen9002: 金币+5 2015-11-07 18:06:18
建议好好优化下你的层析过程,离子交换的用DEAE或CM,先离子交换后镍柱,好好优化下层析过程,比如离子交换时,盐拉梯度,慢一些,镍柱拉梯度时,咪唑梯度慢些上升比如0-500mm,原本50个柱体积,你可以增加到200等,缓冲液在优化优化比如用Tris-Hcl试试,缓冲液中加200mm氯化钠,ph也试试,比如6.0.,7.0,8.0等。多试验。祝顺利。
15楼2015-10-29 13:32:36
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高傲的范儿

金虫 (小有名气)


引用回帖:
10楼: Originally posted by 总有二狗咬朕 at 2015-10-29 09:08:43
Superdex 75分子筛纯化两种蛋白的分子量相差至少2-3倍,所以楼主的蛋白应该无法用Superdex 75进行分离纯化。...

那应该用什么规格的分子筛呢?

发自小木虫Android客户端
16楼2015-10-29 13:41:39
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高傲的范儿

金虫 (小有名气)


引用回帖:
4楼: Originally posted by a86052 at 2015-10-28 16:56:46
不一定的,因为你既然从电泳图上看不出纯化效果,也许过分子筛并不能达到要求。如果像你说的,这些是截短表达,那么构建个C端标签的也许会更好。你可以先检测下是不是截短的蛋白...

怎么检测是不是截短蛋白?

发自小木虫Android客户端
17楼2015-10-29 13:43:18
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高傲的范儿

金虫 (小有名气)


引用回帖:
9楼: Originally posted by xiaochen9002 at 2015-10-29 08:46:27
20mM的PBS与咪唑,没有加吐温20与DTT。...

我室友最近在缓冲液里面加入了DTT和吐温20,去掉了很多带。但不知道是否影响你的蛋白活性,可以试试。

发自小木虫Android客户端
18楼2015-10-29 13:45:34
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a86052

金虫 (正式写手)

引用回帖:
17楼: Originally posted by 高傲的范儿 at 2015-10-29 13:43:18
怎么检测是不是截短蛋白?
...

做个western应该就可以。如果真是截短表达,不妨将TAG构建到蛋白的另一端试下
19楼2015-10-29 14:01:02
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)

引用回帖:
17楼: Originally posted by 高傲的范儿 at 2015-10-29 13:43:18
怎么检测是不是截短蛋白?
...

菌体诱导后,其他的小分子量杂带也会大量出现。我推测是截短表达的。具体鉴定估计得用western,加his-tag的抗体。
20楼2015-10-29 14:44:30
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