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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 蛋白纯化不出来……
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by hc-material at 2015-10-29 13:32:36
建议好好优化下你的层析过程，离子交换的用DEAE或CM，先离子交换后镍柱，好好优化下层析过程，比如离子交换时，盐拉梯度，慢一些，镍柱拉梯度时，咪唑梯度慢些上升比如0-500mm,原本50个柱体积，你可以增加到200等， ...

我用的就是DEAE与CM。目的蛋白PI=5,35。用过PH9,7,6的PBS与NaCl拉的梯度。是分出两个峰，但是电泳检测无纯化效果。可以试试你说的那种先过离子交换柱，再过镍柱，看看效果。
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21楼2015-10-29 14:47:09
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xujian568

至尊木虫 (著名写手)

Count XU

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1. HPLC
2. 把标签放到N端去再试试何如
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活着就要让人感受到你的存在。
22楼2015-10-29 16:01:06
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
21楼: Originally posted by xiaochen9002 at 2015-10-29 14:47:09
我用的就是DEAE与CM。目的蛋白PI=5,35。用过PH9,7,6的PBS与NaCl拉的梯度。是分出两个峰，但是电泳检测无纯化效果。可以试试你说的那种先过离子交换柱，再过镍柱，看看效果。...

先试试DEAE  柱PH 8.0上样，拉梯度洗脱，然后过镍柱，过镍柱时平衡缓冲液里加点咪唑，20mm。试试先，祝顺利。
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23楼2015-10-29 16:24:52
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我是黑宝猪

金虫 (正式写手)
分子筛再试一下吧，可以优化一下条件，流速慢一点，柱子细长一点

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24楼2015-10-29 16:43:56
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总有二狗咬朕

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
xiaochen9002: 金币+10, ★★★很有帮助 2015-11-07 18:04:50
引用回帖:
16楼: Originally posted by 高傲的范儿 at 2015-10-29 13:41:39
那应该用什么规格的分子筛呢？
...

比较适合的就是Superdex 75分子筛，但是这个好像不适用于你的纯化。楼主可以看看是不是截短表达。截短表达是只表达了部分，但是也可能是蛋白质降解，蛋白表达与降解是同时存在的，合成部分肽段不能折叠成正确的构象而被大量降解了。我觉得可以试试亲和层析，杂蛋白应该不会与目的蛋白有同样的结合力。
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我好累，承受这个年纪不该有的帅！
25楼2015-10-30 14:04:17
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总有二狗咬朕

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dllchina: 金币+2, 鼓励交流 2015-10-30 22:06:05
引用回帖:
12楼: Originally posted by xiaochen9002 at 2015-10-29 12:19:38
疯了，不知道咋办了...

楼主可以看看是不是截短表达。截短表达是只表达了部分，但是也可能是蛋白质降解，蛋白表达与降解是同时存在的，合成部分肽段不能折叠成正确的构象而被大量降解了。我觉得可以试试亲和层析，杂蛋白应该不会与目的蛋白有同样的结合力。还有别急，做实验都是这样，总会遇到各种各样的问题，但这也是它的魅力所在，在这个过程中你能从中学到很多很多！
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我好累，承受这个年纪不该有的帅！
26楼2015-10-30 14:10:43
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)
引用回帖:
26楼: Originally posted by 总有二狗咬朕 at 2015-10-30 14:10:43
楼主可以看看是不是截短表达。截短表达是只表达了部分，但是也可能是蛋白质降解，蛋白表达与降解是同时存在的，合成部分肽段不能折叠成正确的构象而被大量降解了。我觉得可以试试亲和层析，杂蛋白应该不会与目的蛋 ...

非常感谢！今天跟老师讨论了一下，老师也认为用亲和层析，多试几个条件。实验还是得一步一步来，不能着急，今天还被老师灌鸡汤了，哈哈……
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27楼2015-10-30 18:24:30
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)
引用回帖:
24楼: Originally posted by 我是黑宝猪 at 2015-10-29 16:43:56
分子筛再试一下吧，可以优化一下条件，流速慢一点，柱子细长一点

恩，我都试试看，希望有效果。谢谢！
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28楼2015-10-30 18:25:34
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等待晨曦

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xiaochen9002: 金币+5, ★有帮助 2015-11-07 18:05:17
摸索纯化条件，我第一次纯化就是摸索，目前纯化了至少12种蛋白。

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严于律己，宽以待人
29楼2015-10-30 18:38:28
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)
引用回帖:
29楼: Originally posted by 等待晨曦 at 2015-10-30 18:38:28
摸索纯化条件，我第一次纯化就是摸索，目前纯化了至少12种蛋白。

真是大牛啊！
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30楼2015-10-30 18:40:45
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