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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 蛋白纯化不出来……
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)

[求助] 蛋白纯化不出来…… 已有6人参与

手上有一个蛋白，大肠表达后镍柱纯化，得到了目的条带，但是还有三条杂带，估计是截短表达的蛋白。目前已经用了好多方法去除杂带，50KDa的超滤管，阴阳离子交换柱以及分子筛，都没分开，不知道各位有什么好的方法没？实在快疯了，  电泳图附上，红色的是我要的条带，静候各位大牛的解答！

蛋白纯化不出来……
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1楼 2015-10-28 15:49:15
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

总有二狗咬朕

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
通常使用超滤来纯化蛋白是，其应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量为61kDa，就可以选择20kDa截留分子量的超滤管，所以用55kDa不行；阴阳离子交换柱没分开，说明纯化的重组蛋白与杂蛋白PI接近。但是分子筛应该是可以分得开的，可能楼主的柱效不高，用标准试剂走着看一下，是否能达到应用的要求。还有看看楼主的填料，可能选择的不好,范围太宽了。
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我好累，承受这个年纪不该有的帅！
5楼2015-10-28 16:59:39
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xiaochen9002: 金币+5 2015-11-07 18:06:18
建议好好优化下你的层析过程，离子交换的用DEAE或CM，先离子交换后镍柱，好好优化下层析过程，比如离子交换时，盐拉梯度，慢一些，镍柱拉梯度时，咪唑梯度慢些上升比如0-500mm,原本50个柱体积，你可以增加到200等，缓冲液在优化优化比如用Tris-Hcl试试，缓冲液中加200mm氯化钠，ph也试试，比如6.0.，7.0,8.0等。多试验。祝顺利。
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15楼2015-10-29 13:32:36
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普通回帖

a86052

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
分子量看起来差了不少，分子筛一点效果都没有？超滤管一般达不到那么好的纯化效果的。实在不行重新构建吧~
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2楼2015-10-28 16:26:44
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by a86052 at 2015-10-28 16:26:44
分子量看起来差了不少，分子筛一点效果都没有？超滤管一般达不到那么好的纯化效果的。实在不行重新构建吧~

分子筛只用过一次，从电泳图上看不出显著地纯化效果。是不是优化下条件就可以了？
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3楼2015-10-28 16:42:33
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a86052

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xiaochen9002 at 2015-10-28 16:42:33
分子筛只用过一次，从电泳图上看不出显著地纯化效果。是不是优化下条件就可以了？...

不一定的，因为你既然从电泳图上看不出纯化效果，也许过分子筛并不能达到要求。如果像你说的，这些是截短表达，那么构建个C端标签的也许会更好。你可以先检测下是不是截短的蛋白
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4楼2015-10-28 16:56:46
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 总有二狗咬朕 at 2015-10-28 16:59:39
通常使用超滤来纯化蛋白是，其应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量为61kDa，就可以选择20kDa截留分子量的超滤管，所以用55kDa不行；阴阳离子交换柱没分开，说明纯化的重组蛋白与杂蛋白PI接 ...

关于超滤管的问题，我已经问公司了，他们说50KDa的超滤管是保证50KDa以上的蛋白不掉下来，其他的不保证，看来是行不通了。分子筛用的是superdex-75，1m左右。具体的柱效没有评估，不知道是不是柱效的问题。
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6楼2015-10-28 17:32:12
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by a86052 at 2015-10-28 16:56:46
不一定的，因为你既然从电泳图上看不出纯化效果，也许过分子筛并不能达到要求。如果像你说的，这些是截短表达，那么构建个C端标签的也许会更好。你可以先检测下是不是截短的蛋白...

恩，我先找找纯化条件，实在不行，只能重新构建啦
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7楼2015-10-28 17:39:32
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高傲的范儿

金虫 (小有名气)
你纯化用的缓冲盐是什么？有没有加吐温20和DTT？

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8楼2015-10-29 08:12:42
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 高傲的范儿 at 2015-10-29 08:12:42
你纯化用的缓冲盐是什么？有没有加吐温20和DTT？

20mM的PBS与咪唑，没有加吐温20与DTT。
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9楼2015-10-29 08:46:27
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总有二狗咬朕

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by xiaochen9002 at 2015-10-28 17:32:12
关于超滤管的问题，我已经问公司了，他们说50KDa的超滤管是保证50KDa以上的蛋白不掉下来，其他的不保证，看来是行不通了。分子筛用的是superdex-75，1m左右。具体的柱效没有评估，不知道是不是柱效的问题。...

Superdex 75分子筛纯化两种蛋白的分子量相差至少2-3倍，所以楼主的蛋白应该无法用Superdex 75进行分离纯化。
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我好累，承受这个年纪不该有的帅！
10楼2015-10-29 09:08:43
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