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七喜丸子金虫 (小有名气)
一枚苦逼的搬砖民工
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[求助]
药物体内生物利用度的测定方案求助 已有1人参与
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本人正在做一个化合物的体内生物利用度的测定，鉴于身边的师兄师姐没有这类的经验因此来小木虫求助各位大牛。如能提供帮助小弟感激不尽。 本人预实验准备用小鼠做，正式试验用大鼠做。我查阅了很多的文献，确定了自己测定绝对生物利用度的实验初步设计，但是随着文献越看越多，问题也逐步而来，主要的问题有几个： 1.给药剂量的确定。因为此前没做过所以该如何确定给药剂量，我要做口服和静注该怎样确定给药剂量？是要拿两只小鼠测试一下致死剂量还是如何。 2.需不需要做空白血浆的干扰实验。就是空白血浆、给药后血浆（仅取单个时间点）进HPLC看血浆内物质是否对药物出峰产生干扰。此外做干扰实验的血浆取自小鼠（由于这周没订到小白鼠下周我想用小黑鼠可以么……），是否可以将此试验结果应用于拿大鼠做的正式试验中去？ 3.血浆的处理。我查到的有两种血浆处理方案，第一种是眼球取血后的血浆不加抗凝剂，在冰箱内静置4h，然后取出离心，取上清液涡旋，最后用甲醇沉淀蛋白后进样。第二种是取血前加入枸橼酸钠（或用肝素化离心管置血）按照与血浆的体积比1:9抗凝，然后离心，加入乙酸乙酯（分析纯）萃取，过滤膜后进样。我的化合物上有一个五元杂环连一个苯，是脂溶性的。在这个问题中我想细问几个问题： ①加不加抗凝剂有什么影响吗？为什么有的文献加了有的没加…… ②是否需要复溶？ ③两种方法哪种更适合我，我知道第一种方法比较麻烦，但是沉淀下来的蛋白和抗凝剂会不会对HPLC有干扰等。换种说法，如果将两种方法中的某些处理步骤互相交换一下是否可行？此外我的师兄（他做体外我做体内）试过第二种方法，但是用乙酸乙酯萃取乳化严重，以致酯层很少量，根本吸不上来，那是否连带乳化的部分也一起吸上来？我怕会有干扰，而且萃取会不会把血浆中的蛋白也萃出来，还是说药物浓度远远高于血浆的空白背景（比如蛋白，加入的抗凝剂的杂峰）所以影响不大？ ④涡旋的原理是不是就是充分混合，我将涡旋换成37℃恒温孵育是否可行？ ⑤为什么第一种方法要在冰箱中静置，室温下是否可行，37℃下呢？ ⑥第二种方法眼球取血后的血量如何严格控制，因为涉及到按比例配制预先加入的抗凝剂的量。 4.预实验的设计。因为我最后的正式试验想做大鼠，毕竟大鼠的重复利用度比小鼠要高很多。我预实验是打算用小鼠做的，共30只，分成10组以对应十个取血的时间点（0，5，10，20，30，45，60min和1.5，2，4h）。时间点有什么需要注意的么？时间点跨度的长短是要拿本次预实验摸条件才能确定么？那么预实验我是否口服和静注都要做还是只做静注？以及30只每组3只我是问了有统计学意义，但是预实验需要这么严谨么……改成10老鼠对应十个时间点是否可行？订这么多做预实验老板会不会火儿……其实我想可不可以多定个几十只小鼠代替大鼠直接做正式试验…… 5.正式试验的给药方法。我打算订10只大鼠，5只静注5只口服。有的小木虫前辈说6只才具有统计学意义，那6只是否是5只给药1只给生理盐水作对照？还是都给药？ 6.正式试验的血样采集。 ①关于采血时间点的确定：我设计的是0-12小时共十个时间点（0，5，10，20，30，45，60min和1.5，2，3，5，8，10，12h），是否需要继续在24h和48h采样?问这个问题是由于我取血方式的不确定导致的。下面有讲到。 ②取血方式的确定。有的文献说尾静脉取血，可以取0.5-1ml。但是大鼠多次取血尾静脉会不会引起取血量减少或者血管受损度加大以至于不易取血？导师当初给的方案是动脉插管取血，但是我担心大鼠不能存活12h以上…… 7.HPLC用不用加内标物，我之前因为没做过所以内标物并不太懂，比不知道怎么选择或者是否一定需要内标物…… 以上为我设计实验中出现的问题，有些多，因为有些查不到所以就像各位求助了  之后在实验进行中肯定依然会有种种问题，希望各位大牛不吝赐教，小弟不胜感激 下周一就要开始正式做了，打算先做血浆干扰试验然后做预实验，最后的数据处理……PS：小弟只是一名做毕设的大四学生，很多知识肯定被比不上各位大牛虫友，所以有些问题可能会简单到不想回答，不过我还是真诚的恳请各位帮助小弟解答一些问题，不胜感激不胜感激  |
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感谢参与，应助指数 +1
七喜丸子: 金币+30, ★★★★★最佳答案, 太感谢了!不过我只是做的本科毕业设计，达不到发文章的水平。。 2014-02-24 12:17:32
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七喜丸子: 金币+30, ★★★★★最佳答案, 太感谢了!不过我只是做的本科毕业设计，达不到发文章的水平。。 2014-02-24 12:17:32
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问题很多，但是你的研究目的不是非常明确。你是想发表文章，还是做新药申报材料，还是探索性研究。不同的目的对应不同的要求。请先确定自己的目的。 1.给药剂量的确定。 考虑到已经有提取方法的报道，所以我推测你研究的是一个已经上市的药物。请查阅这个药物的DMPK文献，最好参照文献制定的剂量。假如没有相关文献，根据自己定量方法的定量下限来确定剂量，尽量降低研究剂量。没有必要做毒理试验确定剂量，这既不经济也无必要。 2.需不需要做空白血浆的干扰实验。 这个项目叫分析方法学专属性考察，是方法学研究的一部分。假如是探索性试验，这个不需要做。因为标准曲线里面有空白样品，一看就知道是否有干扰。但是假如是发表文章或者是做申报材料，这个必不可少。当然，只做这个是不够的，分析测试方法包含很多项目。做法也有讲究，不再细说。 3.血浆的处理。你两种方法都可以，取决于你要测定什么样品的浓度，静置法测定的是血清浓度，所以不加抗凝剂。加抗凝处理测定的是血浆浓度。两种浓度和全血浓度都有一定相关性，不能说哪个更好，这个是见仁见智的事情。既然文献两种都有报道，你选择其一即可。个人推荐测定血浆浓度。对于取血清的几个细节问题，不建议用你设想的方法，主要是考虑到药品在你所说条件的稳定性问题。假如一定要用，需要增加稳定性考察，得不偿失。眼球取血是个技术活，取得好凭这个能力可以找个技术员的工作了，怎么说都没有用，需要一定的练习，才能取好。不用担心失血的问题，因为取够你需要的血量，可以压迫眼球止血的。 4.试验动物的选择。 先小动物后大动物是原则，在满足试验需求的前提下尽量减少动物用量。所以还是那句话，看你的试验目的。 5. 大鼠试验设计 试验动物通常情况下个体差异较小，因此对于你这个研究n=6，雌雄各半是可以接受的。没有必要做空白对照，除非你的待测药物是体内的正常物质。假如是体内已有物质，你空白对照一只也肯定不够。 6. 采血时间点的确定。 有没有这个药物的半衰期数据？根据这个参照自己的剂量和分析方法定量下限制定采样点。 7. 内标问题。 这个依然属于方法学开发方面的问题。建议读一下分析方法学验证方面的文章，再来讨论。 |
2楼2014-02-24 10:14:42
