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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 蛋白纯化不出来……
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)

[求助] 蛋白纯化不出来…… 已有6人参与

手上有一个蛋白，大肠表达后镍柱纯化，得到了目的条带，但是还有三条杂带，估计是截短表达的蛋白。目前已经用了好多方法去除杂带，50KDa的超滤管，阴阳离子交换柱以及分子筛，都没分开，不知道各位有什么好的方法没？实在快疯了，  电泳图附上，红色的是我要的条带，静候各位大牛的解答！

蛋白纯化不出来……
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1楼 2015-10-28 15:49:15
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 总有二狗咬朕 at 2015-10-28 16:59:39
通常使用超滤来纯化蛋白是，其应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量为61kDa，就可以选择20kDa截留分子量的超滤管，所以用55kDa不行；阴阳离子交换柱没分开，说明纯化的重组蛋白与杂蛋白PI接 ...

关于超滤管的问题，我已经问公司了，他们说50KDa的超滤管是保证50KDa以上的蛋白不掉下来，其他的不保证，看来是行不通了。分子筛用的是superdex-75，1m左右。具体的柱效没有评估，不知道是不是柱效的问题。
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6楼2015-10-28 17:32:12
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a86052

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
分子量看起来差了不少，分子筛一点效果都没有？超滤管一般达不到那么好的纯化效果的。实在不行重新构建吧~
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2楼2015-10-28 16:26:44
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by a86052 at 2015-10-28 16:26:44
分子量看起来差了不少，分子筛一点效果都没有？超滤管一般达不到那么好的纯化效果的。实在不行重新构建吧~

分子筛只用过一次，从电泳图上看不出显著地纯化效果。是不是优化下条件就可以了？
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3楼2015-10-28 16:42:33
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a86052

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xiaochen9002 at 2015-10-28 16:42:33
分子筛只用过一次，从电泳图上看不出显著地纯化效果。是不是优化下条件就可以了？...

不一定的，因为你既然从电泳图上看不出纯化效果，也许过分子筛并不能达到要求。如果像你说的，这些是截短表达，那么构建个C端标签的也许会更好。你可以先检测下是不是截短的蛋白
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4楼2015-10-28 16:56:46
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