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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 蛋白纯化不出来……
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)

[求助] 蛋白纯化不出来…… 已有6人参与

手上有一个蛋白，大肠表达后镍柱纯化，得到了目的条带，但是还有三条杂带，估计是截短表达的蛋白。目前已经用了好多方法去除杂带，50KDa的超滤管，阴阳离子交换柱以及分子筛，都没分开，不知道各位有什么好的方法没？实在快疯了，  电泳图附上，红色的是我要的条带，静候各位大牛的解答！

蛋白纯化不出来……
效果图.png
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1楼 2015-10-28 15:49:15
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总有二狗咬朕

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
xiaochen9002: 金币+10, ★★★很有帮助 2015-11-07 18:04:50
引用回帖:
16楼: Originally posted by 高傲的范儿 at 2015-10-29 13:41:39
那应该用什么规格的分子筛呢？
...

比较适合的就是Superdex 75分子筛，但是这个好像不适用于你的纯化。楼主可以看看是不是截短表达。截短表达是只表达了部分，但是也可能是蛋白质降解，蛋白表达与降解是同时存在的，合成部分肽段不能折叠成正确的构象而被大量降解了。我觉得可以试试亲和层析，杂蛋白应该不会与目的蛋白有同样的结合力。
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我好累，承受这个年纪不该有的帅！
25楼2015-10-30 14:04:17
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a86052

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
分子量看起来差了不少，分子筛一点效果都没有？超滤管一般达不到那么好的纯化效果的。实在不行重新构建吧~
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2楼2015-10-28 16:26:44
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xiaochen9002

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by a86052 at 2015-10-28 16:26:44
分子量看起来差了不少，分子筛一点效果都没有？超滤管一般达不到那么好的纯化效果的。实在不行重新构建吧~

分子筛只用过一次，从电泳图上看不出显著地纯化效果。是不是优化下条件就可以了？
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3楼2015-10-28 16:42:33
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a86052

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xiaochen9002 at 2015-10-28 16:42:33
分子筛只用过一次，从电泳图上看不出显著地纯化效果。是不是优化下条件就可以了？...

不一定的，因为你既然从电泳图上看不出纯化效果，也许过分子筛并不能达到要求。如果像你说的，这些是截短表达，那么构建个C端标签的也许会更好。你可以先检测下是不是截短的蛋白
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4楼2015-10-28 16:56:46
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