24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
汕头大学海洋科学接受调剂
查看: 3528  |  回复: 9

jjsh310

金虫 (小有名气)

[求助] EGFP融合蛋白的表达 已有2人参与

最近做了EGFP的N端融合,目的基因2.4k左右.    载体pEGFP-N1    CMV启动子
转染HEK293T细胞后荧光强度弱,是不是融合了插入基因后表达效率低了,还是因为插入的基因影响EGFP的折叠了?
各位做过融合的,这种现象是正常的吗,还是我的载体构建有问题。
还有个问题:N端融合时目的基因有ATG,EGFP的ATG要不要去掉?我的目的基因和EGFP之间有蛋白酶切位点,后续会被切开。
最近这个问题一直困扰着我,诚恳求教。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

初来乍到··
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
这是瞬时转染?应该不是插入基因的问题
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
2楼2015-08-14 10:21:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jjsh310

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-08-14 10:21:20
这是瞬时转染?应该不是插入基因的问题

嗯,是瞬时转染,荧光强度相对于空载来说特别弱。如果不是插入基因的问题是什么的问题呢?基因太大了表达量低吗?
初来乍到··
3楼2015-08-14 10:42:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ghqiu09

禁虫 (正式写手)


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-08-17 23:24:52
本帖内容被屏蔽

4楼2015-08-14 11:36:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ghqiu09

禁虫 (正式写手)


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-08-17 23:24:39
本帖内容被屏蔽

5楼2015-08-14 11:40:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jjsh310

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by ghqiu09 at 2015-08-14 11:36:44
你的转染效率低了,没啥。你也可以做个流式,看看转染效率

转染效率的问题已经优化好久了,各种转染试剂也试过了,就是不太亮,要么就是细胞转态不好,飘起来了。最近要试试反向转染,不知道各位有没有做过这个。或者有更好的建议。为这已经磨蹭好几个月了,诚求各位大侠的经验。
初来乍到··
6楼2015-08-14 12:10:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jjsh310

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by ghqiu09 at 2015-08-14 11:40:12
293T的转染要特别小心,换液之类的要慢,贴壁加培养基啥的就不说了,细胞飘起来后就影响转染效率

嗯,是得特别小心,换液稍不注意细胞就飘了,因为我要先转质粒再转RNA所以对细胞的伤害更是大。小心翼翼,不敢怠慢。就是平衡不好这个度,细胞最后被折腾的四零八散的。转染效率就是提不高。
初来乍到··
7楼2015-08-14 12:13:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ghqiu09

禁虫 (正式写手)

本帖内容被屏蔽

8楼2015-08-14 12:25:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ghqiu09

禁虫 (正式写手)

本帖内容被屏蔽

9楼2015-08-14 12:46:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jjsh310

金虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by ghqiu09 at 2015-08-14 12:46:48
你转染用啥转?我们用lip2000,和质粒的比是2:1到1:1
...

我也用Lipo2000,不过我是3:1    试过2:1,荧光强度相对弱些。
初来乍到··
10楼2015-08-17 15:11:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 jjsh310 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 求调剂学校 +13 不会吃肉 2026-04-13 15/750 2026-04-15 12:49 by 西北望—风沙
[考研] 327求调剂 +23 Xxjc1107. 2026-04-13 25/1250 2026-04-14 18:48 by 逍遥三郎
[考研] 一志愿中国科学院上海有机所,有机化学356分找调剂 +12 Nadiums 2026-04-09 13/650 2026-04-14 17:54 by lhj2009
[考研] 化工学硕294分,求导师收留 +32 yzyzx 2026-04-12 36/1800 2026-04-14 17:45 by lhj2009
[考研] 材料299专硕求调剂 +16 +21 2026-04-09 16/800 2026-04-14 17:06 by jiangguiquan11
[考研] 290求调剂 +21 luoziheng 2026-04-10 23/1150 2026-04-14 15:49 by zs92450
[考研] 求调剂 +20 MAX怅惘 2026-04-09 22/1100 2026-04-14 14:57 by 独醉梦孤城
[考研] 求调剂 +12 何气正 2026-04-13 13/650 2026-04-14 14:47 by zs92450
[考研] 297求调剂 +23 ORCHID1 2026-04-10 26/1300 2026-04-14 13:52 by 陈皮皮
[考研] B区0809 ,数一英一,290 求调剂 +3 泠潍1111 2026-04-12 4/200 2026-04-13 20:35 by 学员JpLReM
[考研] 339求调剂 +8 hanwudada 2026-04-11 9/450 2026-04-12 15:36 by laoshidan
[考研] 0860004 求调剂 309分 +9 Yin DY 2026-04-08 9/450 2026-04-11 22:55 by dongdian1
[考研] 270求调剂 +14 杨乐369 2026-04-11 14/700 2026-04-11 20:16 by 蓝云思雨
[考研] 288求调剂 +15 代fish 2026-04-09 16/800 2026-04-11 10:26 by wwj2530616
[考研] 284求调剂 +12 archer.. 2026-04-10 13/650 2026-04-11 08:44 by zhq0425
[考研] 一志愿北理工298英一数二已上岸,感谢各位老师 +14 Reframe 2026-04-10 16/800 2026-04-10 23:07 by caotw2020
[考研] 吉大计算机技术331分,英语六级,求调剂 +3 峰峰021116 2026-04-09 3/150 2026-04-10 20:01 by chemisry
[考研] 初试分332,一志愿报考西北工业大学, +11 故人?? 2026-04-09 11/550 2026-04-09 21:54 by JineShine
[考研] 070300化学 求调剂 +13 73372112 2026-04-08 13/650 2026-04-09 20:22 by maddjdld
[考研] 材料专硕初试分332一志愿西北工业大学, +12 故人?? 2026-04-09 12/600 2026-04-09 18:34 by Ccclqqq
信息提示
请填处理意见