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niini123

铜虫 (初入文坛)

[求助] 关于载体的问题

小弟最近遇到点问题，很是头疼，请教大家一下。

上个月的时候，我构建了一个蛋白的FLAG融合表达载体，测序没有问题。转染以后，定量和半定量，都有结果，上调500倍左右。当时没做WESTERN直接做的IP，结果验证不到FLAG的表达。一直没解决。

这几天又构建了同一个蛋白的EGFP的载体，测序没问题。可是转染以后，完全看不到绿色荧光。

请问到底是什么原因？这个蛋白在细胞中本身也有表达。
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有时候头很疼
1楼 2012-04-02 16:50:51
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超然渡陈

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, Good!果断优秀~ 2012-04-03 15:07:45
一，你构建载体所用的是成熟肽还是带有信号肽的全长肽？假如是分泌蛋白的话必须去掉信号肽才能做功能和定位研究。不然你的目的蛋白都大量分泌到胞外了，胞内残留的那一点用一般方法检查很困难。
二，是不是你的目的蛋白过大？在与Flag或者GFP融合表达的时候会吧这两个蛋白包被在中间？
三，构建载体的时候目的蛋白和Flag或者GFP直接要加一个linker，二者直接连接的话会影响彼此的空间构象。
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2楼2012-04-03 10:46:26
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