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jjsh310

金虫 (小有名气)

[求助] EGFP融合蛋白的表达 已有2人参与

最近做了EGFP的N端融合,目的基因2.4k左右.    载体pEGFP-N1    CMV启动子
转染HEK293T细胞后荧光强度弱,是不是融合了插入基因后表达效率低了,还是因为插入的基因影响EGFP的折叠了?
各位做过融合的,这种现象是正常的吗,还是我的载体构建有问题。
还有个问题:N端融合时目的基因有ATG,EGFP的ATG要不要去掉?我的目的基因和EGFP之间有蛋白酶切位点,后续会被切开。
最近这个问题一直困扰着我,诚恳求教。
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初来乍到··
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
这是瞬时转染?应该不是插入基因的问题
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
2楼2015-08-14 10:21:20
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jjsh310

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-08-14 10:21:20
这是瞬时转染?应该不是插入基因的问题

嗯,是瞬时转染,荧光强度相对于空载来说特别弱。如果不是插入基因的问题是什么的问题呢?基因太大了表达量低吗?
初来乍到··
3楼2015-08-14 10:42:28
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ghqiu09

禁虫 (正式写手)


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-08-17 23:24:52
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4楼2015-08-14 11:36:44
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ghqiu09

禁虫 (正式写手)


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-08-17 23:24:39
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5楼2015-08-14 11:40:12
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jjsh310

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by ghqiu09 at 2015-08-14 11:36:44
你的转染效率低了,没啥。你也可以做个流式,看看转染效率

转染效率的问题已经优化好久了,各种转染试剂也试过了,就是不太亮,要么就是细胞转态不好,飘起来了。最近要试试反向转染,不知道各位有没有做过这个。或者有更好的建议。为这已经磨蹭好几个月了,诚求各位大侠的经验。
初来乍到··
6楼2015-08-14 12:10:26
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jjsh310

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by ghqiu09 at 2015-08-14 11:40:12
293T的转染要特别小心,换液之类的要慢,贴壁加培养基啥的就不说了,细胞飘起来后就影响转染效率

嗯,是得特别小心,换液稍不注意细胞就飘了,因为我要先转质粒再转RNA所以对细胞的伤害更是大。小心翼翼,不敢怠慢。就是平衡不好这个度,细胞最后被折腾的四零八散的。转染效率就是提不高。
初来乍到··
7楼2015-08-14 12:13:18
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ghqiu09

禁虫 (正式写手)

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8楼2015-08-14 12:25:24
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ghqiu09

禁虫 (正式写手)

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9楼2015-08-14 12:46:48
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jjsh310

金虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by ghqiu09 at 2015-08-14 12:46:48
你转染用啥转?我们用lip2000,和质粒的比是2:1到1:1
...

我也用Lipo2000,不过我是3:1    试过2:1,荧光强度相对弱些。
初来乍到··
10楼2015-08-17 15:11:54
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