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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » EGFP融合蛋白的表达
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jjsh310

金虫 (小有名气)

[求助] EGFP融合蛋白的表达 已有2人参与

最近做了EGFP的N端融合，目的基因2.4k左右.    载体pEGFP-N1    CMV启动子
转染HEK293T细胞后荧光强度弱，是不是融合了插入基因后表达效率低了，还是因为插入的基因影响EGFP的折叠了？
各位做过融合的，这种现象是正常的吗，还是我的载体构建有问题。
还有个问题：N端融合时目的基因有ATG，EGFP的ATG要不要去掉？我的目的基因和EGFP之间有蛋白酶切位点，后续会被切开。
最近这个问题一直困扰着我，诚恳求教。
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初来乍到··
1楼 2015-08-14 10:04:27
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这是瞬时转染？应该不是插入基因的问题
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
2楼2015-08-14 10:21:20
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jjsh310

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-08-14 10:21:20
这是瞬时转染？应该不是插入基因的问题

嗯，是瞬时转染，荧光强度相对于空载来说特别弱。如果不是插入基因的问题是什么的问题呢？基因太大了表达量低吗？
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初来乍到··
3楼2015-08-14 10:42:28
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ghqiu09

禁虫 (正式写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-08-17 23:24:52
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4楼2015-08-14 11:36:44
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ghqiu09

禁虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-08-17 23:24:39
本帖内容被屏蔽
5楼2015-08-14 11:40:12
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jjsh310

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ghqiu09 at 2015-08-14 11:36:44
你的转染效率低了，没啥。你也可以做个流式，看看转染效率

转染效率的问题已经优化好久了，各种转染试剂也试过了，就是不太亮，要么就是细胞转态不好，飘起来了。最近要试试反向转染，不知道各位有没有做过这个。或者有更好的建议。为这已经磨蹭好几个月了，诚求各位大侠的经验。
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初来乍到··
6楼2015-08-14 12:10:26
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jjsh310

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ghqiu09 at 2015-08-14 11:40:12
293T的转染要特别小心，换液之类的要慢，贴壁加培养基啥的就不说了，细胞飘起来后就影响转染效率

嗯，是得特别小心，换液稍不注意细胞就飘了，因为我要先转质粒再转RNA所以对细胞的伤害更是大。小心翼翼，不敢怠慢。就是平衡不好这个度，细胞最后被折腾的四零八散的。转染效率就是提不高。
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初来乍到··
7楼2015-08-14 12:13:18
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ghqiu09

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
8楼2015-08-14 12:25:24
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ghqiu09

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
9楼2015-08-14 12:46:48
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jjsh310

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by ghqiu09 at 2015-08-14 12:46:48
你转染用啥转？我们用lip2000，和质粒的比是2:1到1:1
...

我也用Lipo2000，不过我是3：1    试过2:1，荧光强度相对弱些。
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初来乍到··
10楼2015-08-17 15:11:54
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