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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 怎样提高融合蛋白表达量
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)

[求助] 怎样提高融合蛋白表达量 已有6人参与

在BL21菌株中诱导表达蛋白，用的是GST标签，做了几次发现上清里面诱导的蛋白很少，挂柱洗脱后几乎看不见条带。沉淀（包涵体）蛋白还比较多。诱导条件试过IPTG 0.5mM 16度过夜，但IPTG 改成0.3mM 16度过夜后总体诱导表达量就减少了，上清沉淀都少，该怎么解决呢？最后蛋白是要用来测酶活的，所以诱导纯化过程不能破坏酶活。请有经验者帮助！
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1楼 2015-08-02 19:49:25
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
weizhi111: 金币+3, ★★★很有帮助 2015-08-04 14:44:17
weizhi111: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-08-05 07:57:09
像楼上说的，不知道楼主摇菌转速多少，太快也不好，我们实验室常用170rpm，我也做过几次BL21的GST蛋白提取，加的时0.4mM的IPTG，30度3小时，回收量还不错，还有，根据培养基的组成不同，也会很大程度的影响蛋白产生量，比如，我回收TBP的时候，起初，用的培养基是Tryptone or polypeptone 5g，NaCl  1.25 g，NH4Cl  0.5g，KH2PO4 1.5g，Na2HPO412H2O 4.01g，up to 500ml, 取50ml培养回收，这时效率，上清大概是沉淀的50%（上清含量少），而后，我将培养基改成NaCl 0.5 g，NH4Cl  1g，KH2PO4  3g，Na2HPO412H2O  15g，up to 500ml；用时另外加入：1M MgSO4 1ml，2M Glucose  5.6ml，1% Vitamin B1(thiamine)  1ml，1M CaCl2 0.1ml。取50ml培养回收，反应条件30度2-4小时 OD600:0.4～0.8后加入IPTG，之后16度 24小时，回收TBP效率提高一倍。当然这也只是我做的个例，不能保证适用于所有的蛋白，仅供楼主参考，可以考虑改变下培养基成分，祝楼主早日解决问题。
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7楼2015-08-03 20:13:41
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ksws0465326

金虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by weizhi111 at 2015-08-05 07:57:51
请问你破菌时超声一般用什么条件？...

我做的时候，是这样，50ml培养基，菌摇起来OD600 在0.4-0.8后先取出4ml作为Pre－IPTG control，然后剩余的加入IPTG，继续培养，然后回收Past-IPTG sample，离心去上清，加入buffer进行破碎，control加300微 buffer，sample加600微，超声破碎条件是冰上操作，control 5sec/回，sample 10sec/回，间隔10-20sec，8回破碎，然后回收。我回收TBP也是30KD左右，效率还行，就是不知道是否适用于楼主的蛋白了
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20楼2015-08-05 08:29:55
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wufeng1991

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by weizhi111 at 2015-08-04 14:48:02
我看32a的图谱含有His,S, Trx三种标签，请问你一般用哪种？...

trxa是促溶的，另外两种是用来纯化的

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14楼2015-08-04 20:24:44
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普通回帖

wufeng1991

新虫 (小有名气)
把iptg改回来不就行了，加到1mM

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2楼2015-08-02 21:32:35
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wufeng1991 at 2015-08-02 21:32:35
把iptg改回来不就行了，加到1mM

可是IPTG浓度大了不是更容易形成包涵体吗？第一次用0.5mM的时候就很多包涵体，上清里面很少。
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3楼2015-08-03 08:40:19
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wufeng1991

新虫 (小有名气)
个人感觉gst促溶能力并不是很好，不如pet32a和sumo,mbp

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4楼2015-08-03 13:11:46
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zxfeffie

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
诱导时转速是多少，太快了可能也不好，我们都是用180 rpm，你可以试试。
也可能是你自己蛋白的原因造成的沉淀，换换MBP标签试试。
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5楼2015-08-03 15:27:26
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cs冰凝

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
通过变性再复性，这样酶活也可以保证！不知你破菌是用超声还是高压破碎机？

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唯地生物，您身边的感受态专家
6楼2015-08-03 18:56:24
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cs冰凝 at 2015-08-03 18:56:24
通过变性再复性，这样酶活也可以保证！不知你破菌是用超声还是高压破碎机？

我破菌用的是超声。请问怎样变形复性呢？
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8楼2015-08-04 14:40:04
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by ksws0465326 at 2015-08-03 20:13:41
像楼上说的，不知道楼主摇菌转速多少，太快也不好，我们实验室常用170rpm，我也做过几次BL21的GST蛋白提取，加的时0.4mM的IPTG，30度3小时，回收量还不错，还有，根据培养基的组成不同，也会很大程度的影响蛋白产生 ...

非常感谢！你的培养基成分还真复杂，比我们实验室用的复杂多了，我们用的是B培养基，1 L培养基里含有 10g NaCl, 10g 胰蛋白胨， 5g酵母提取物。就这几样，成分很简单，不知道是不是培养基的影响。下次可以考虑试试你的配方。
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9楼2015-08-04 14:44:03
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生物小猴子呢

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你可以从IPTG的浓度、诱导的温度、诱导的转速以及诱导时间等条件进行摸索，IPTG浓度过高会使得包涵体含量增加，BL21是大肠杆菌，最适温度37℃，但是建议往下降温度，温度过高合成蛋白速率过快就有可能造成目的蛋白来不及正确折叠因而大部分形成包涵体，诱导转速过快也是是一样。本人也是刚开始做，一点点小经验可以参考一下。有时候你可以试着换换载体或者宿主细胞，表达量也会不同。我用过Transtta(DE3) 感受态细胞，表达量会比BL21高，只是我个人这样，你可以试试。
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10楼2015-08-04 14:45:57
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