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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)

[求助] 怎样提高融合蛋白表达量 已有6人参与

在BL21菌株中诱导表达蛋白,用的是GST标签,做了几次发现上清里面诱导的蛋白很少,挂柱洗脱后几乎看不见条带。沉淀(包涵体)蛋白还比较多。诱导条件试过IPTG 0.5mM 16度过夜,但IPTG 改成0.3mM 16度过夜后总体诱导表达量就减少了,上清沉淀都少,该怎么解决呢?最后蛋白是要用来测酶活的,所以诱导纯化过程不能破坏酶活。请有经验者帮助!
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

引用回帖:
18楼: Originally posted by weizhi111 at 2015-08-05 07:57:51
请问你破菌时超声一般用什么条件?...

我做的时候,是这样,50ml培养基,菌摇起来OD600 在0.4-0.8后先取出4ml作为Pre-IPTG control,然后剩余的加入IPTG,继续培养,然后回收Past-IPTG sample,离心去上清,加入buffer进行破碎,control加300微 buffer,sample加600微,超声破碎条件是冰上操作,control 5sec/回,sample 10sec/回,间隔10-20sec,8回破碎,然后回收。我回收TBP也是30KD左右,效率还行,就是不知道是否适用于楼主的蛋白了
20楼2015-08-05 08:29:55
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wufeng1991

新虫 (小有名气)

把iptg改回来不就行了,加到1mM

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
2楼2015-08-02 21:32:35
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wufeng1991 at 2015-08-02 21:32:35
把iptg改回来不就行了,加到1mM

可是IPTG浓度大了不是更容易形成包涵体吗?第一次用0.5mM的时候就很多包涵体,上清里面很少。
3楼2015-08-03 08:40:19
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wufeng1991

新虫 (小有名气)

个人感觉gst促溶能力并不是很好,不如pet32a和sumo,mbp

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
4楼2015-08-03 13:11:46
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