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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 怎样提高融合蛋白表达量
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)

[求助] 怎样提高融合蛋白表达量 已有6人参与

在BL21菌株中诱导表达蛋白，用的是GST标签，做了几次发现上清里面诱导的蛋白很少，挂柱洗脱后几乎看不见条带。沉淀（包涵体）蛋白还比较多。诱导条件试过IPTG 0.5mM 16度过夜，但IPTG 改成0.3mM 16度过夜后总体诱导表达量就减少了，上清沉淀都少，该怎么解决呢？最后蛋白是要用来测酶活的，所以诱导纯化过程不能破坏酶活。请有经验者帮助！
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1楼 2015-08-02 19:49:25
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
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2楼: Originally posted by wufeng1991 at 2015-08-02 21:32:35
把iptg改回来不就行了，加到1mM

可是IPTG浓度大了不是更容易形成包涵体吗？第一次用0.5mM的时候就很多包涵体，上清里面很少。
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3楼2015-08-03 08:40:19
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
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6楼: Originally posted by cs冰凝 at 2015-08-03 18:56:24
通过变性再复性，这样酶活也可以保证！不知你破菌是用超声还是高压破碎机？

我破菌用的是超声。请问怎样变形复性呢？
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8楼2015-08-04 14:40:04
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
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7楼: Originally posted by ksws0465326 at 2015-08-03 20:13:41
像楼上说的，不知道楼主摇菌转速多少，太快也不好，我们实验室常用170rpm，我也做过几次BL21的GST蛋白提取，加的时0.4mM的IPTG，30度3小时，回收量还不错，还有，根据培养基的组成不同，也会很大程度的影响蛋白产生 ...

非常感谢！你的培养基成分还真复杂，比我们实验室用的复杂多了，我们用的是B培养基，1 L培养基里含有 10g NaCl, 10g 胰蛋白胨， 5g酵母提取物。就这几样，成分很简单，不知道是不是培养基的影响。下次可以考虑试试你的配方。
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9楼2015-08-04 14:44:03
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
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4楼: Originally posted by wufeng1991 at 2015-08-03 13:11:46
个人感觉gst促溶能力并不是很好，不如pet32a和sumo,mbp

我看32a的图谱含有His,S, Trx三种标签，请问你一般用哪种？
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11楼2015-08-04 14:48:02
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
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10楼: Originally posted by 生物小猴子呢 at 2015-08-04 14:45:57
你可以从IPTG的浓度、诱导的温度、诱导的转速以及诱导时间等条件进行摸索，IPTG浓度过高会使得包涵体含量增加，BL21是大肠杆菌，最适温度37℃，但是建议往下降温度，温度过高合成蛋白速率过快就有可能造成目的蛋白来 ...

我诱导一般16度过夜，温度已经挺低了。请问Transtta(DE3)细胞表达的蛋白可溶性怎样呢？
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12楼2015-08-04 14:53:04
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
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14楼: Originally posted by wufeng1991 at 2015-08-04 20:24:44
trxa是促溶的，另外两种是用来纯化的
...

哦，原来是这样。谢谢，我试试。
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16楼2015-08-05 07:55:45
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
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15楼: Originally posted by whb21 at 2015-08-05 07:20:12
bl21并非全能表达系统 尤其是一些分子量较大的真核蛋白 在表达时容易形成包涵体 调整诱导表达条件确实能够提高可溶性表达 但程度有限 可以尝试更换表达系统

我的蛋白也不大啊，就30多KD。
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17楼2015-08-05 07:56:30
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by ksws0465326 at 2015-08-03 20:13:41
像楼上说的，不知道楼主摇菌转速多少，太快也不好，我们实验室常用170rpm，我也做过几次BL21的GST蛋白提取，加的时0.4mM的IPTG，30度3小时，回收量还不错，还有，根据培养基的组成不同，也会很大程度的影响蛋白产生 ...

请问你破菌时超声一般用什么条件？
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18楼2015-08-05 07:57:51
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
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6楼: Originally posted by cs冰凝 at 2015-08-03 18:56:24
通过变性再复性，这样酶活也可以保证！不知你破菌是用超声还是高压破碎机？

请问你破菌时用什么条件？
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19楼2015-08-05 07:58:17
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